1型IP3受体参与萝卜硫素诱导的细胞凋亡

斯洛伐克临床与转化研究所的SonaHudecova等人于年4月在《Oncotarget》（IF=5.，医学1区期刊）发表了题为“Sulforaphane-inducedapoptosisinvolvesthetype1IP3receptor”的文章。文章主要内容为：

在本研究中，我们发现萝卜硫素（SFN）的抗肿瘤作用部分通过1型肌醇1，4，5-三磷酸受体(IP3R1)来实现。这个作用在体外实验的三个稳定细胞系以及裸鼠肿瘤模型的体内实验均被证实。卵巢癌细胞A经SFN处理后的早期反应（6h）包括线粒体活性氧的生成、NRF2及其下游基因（包括血红素氧化酶1、NADPH:奎宁氧化还原酶1和KLF9）的转录上调。持续给予SFN（24h）能上调NRF2和IP3R1的表达。SFN能引起热休克蛋白27（HSP27）产生时间依赖性的磷酸化修饰变化。IP3R受体抑制剂(Xest)能减弱SFN诱导的细胞凋亡及NRF2表达。此外，Xest能部分减弱SFN的体内抗肿瘤作用。在这些细胞中，干扰IP3R1基因后SFN诱导细胞凋亡被完全抑制，干扰NRF2基因后SFN诱导细胞凋亡被部分抑制，而干扰IP3R2和IP3R3则SFN诱导细胞凋亡没有影响。Xest不能对SFN诱导的ARE应答元件和AP1应答元件活性增加产生显著的影响。本文发现Xest可有效的逆转SFN依赖性的细胞核钙增加以及内质网钙的减少。此外，IP3R1免疫荧光分析显示SFN能诱导IP3R1向细胞核迁移。我们的结果清晰的显示IP3R1通过消耗内质网钙以及通过上调核钙调控转录因子来参与SFN诱导细胞凋亡。

萝卜硫素（SFN），一种食用性异硫氰酸酯，由黑芥子酶酶解天然硫代葡萄糖苷产生，其前体硫代葡萄糖苷大量存在于十字花科蔬菜中，包括西兰花，甘蓝和花椰菜。SFN已经被证实具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等功效，且胞内浓度是胞外-倍。SFN通过核转录因子Nrf2发挥治疗作用，Nrf2是参与调节细胞氧化应激防御的关键转录因子。SFN激活Nrf2能显著增加脑组织和肿瘤组织中微血管中内源性细胞保护基因的表达。1,4,5三磷酸肌醇受体(IP3Rs)通过调节从内质网向细胞质流动的钙通道来参与细胞存活与坏死等活动。目前已发现的IP3Rs有1、2、3三种类型，其中1型和2型已被证实参与诱导细胞凋亡。因此，IP3Rs可能是由内质网活动和/或线粒体机制刺激引发凋亡的关键调控因子。先前，我们证实诱导细胞凋亡会导致1型IP3Rs增加，并且随后迁移到核。这个迁移可能导致核内钙浓度的急剧变化，随之发生的是许多反应元件和转录因子的变化。因此，本文提出假设：SFN可能也刺激IP3Rs，通过这些受体参与诱导细胞凋亡。

Cellsandtreatment细胞株

Phosphorylationassay磷酸化测定

Intracellularandmitochondrialreactiveoxygenspecies(ROS)assay细胞内和线粒体活性氧测定

Glutathioneassay谷胱甘肽测定

DetectionofapoptosiswithAnnexin-V-FLUOS细胞凋亡实验

Westernblotanalysis蛋白质印迹分析

Transienttransfection瞬时转染

SilencingbysiRNAs基因干扰

[Ca2+]freemeasurementwithRhod-5N钙离子测定

10.Cignalfnderreporterarray(SABiosciences)信号通路分析

11.Analysisofthegeneexpressionbyreal-timePCR实时定量荧光PCR

12.Immuno?uorescence免疫荧光

13.Invivoexperimentsonnudemice裸鼠体内实验

1.萝卜硫素（SFN）剂量依赖性促进细胞凋亡并时间依赖性的调节谷胱甘肽和活性氧含量

图1：萝卜硫素（SFN）剂量依赖性促进细胞凋亡（A）并时间依赖性调节谷胱甘肽（B）和活性氧（C,D）。将A细胞用SFN终浓度为2μM(SFN2),20μM(SFN20)和μM(SFN)处理24h。用AnnexinV-FLUOS检测细胞凋亡（A；空白柱子），用PI检测凋亡/坏死（A；黑色柱子）。SFN2和SFN20促进细胞凋亡，而SFN导致细胞大量坏死。SFN给药处理后，谷胱甘肽含量在两个时间点均增加（6h和24h；B），且SFN处理24h后增加幅度更明显。SFN给药处理24h后，线粒体和胞内活性氧明显减少，而给药6h后线粒体活性氧有所增加，胞内活性氧基本不变（C，D）。每个柱子的数值均是平均值±S.E.M，代表三组独立样本的平均值，每组三个平行。统计学意义*表示与相应的control相比p0.05和***p0.。

2.细胞磷酸化反应

图2：A细胞中SFN给药处理后磷酸化反应。SFN(20μM)给药处理后，利用12磷蛋白质测验观测到JNK,p38andp90RSK的磷酸化。在0min，30min，3h和24h时检测磷酸化。结果以对应对照组的增加倍数表示。

3.SFN上调NRF2的表达及与IP3Rs的关系

图3：在卵巢癌细胞A、SKOV3和乳腺癌细胞MDA-MB-中，SFN（20μM）给药处理后，NRF2的过表达与IP3Rs有关。（A）SFN可上调A细胞中IP3R1的表达，而对IP3R2和IP3R3没有影响，GAPDH作为内参。（B，C）进一步转染IP3R1(IP1OE)随后SFN给药处理并确定NRF2蛋白和细胞凋亡的数量。我们观察到NRF2蛋白（C）和细胞凋亡的数量（C）与SFN给药处理的野生型A细胞相比均有明显增加。而且，我们在SKOV3和MDA-MB-细胞中也证实SFN能上调NRF2蛋白的表达。（D）当使用Xest和SFN平行给药时，这种上调被抑制。每个柱子的数值均是平均值±S.E.M，代表三组独立样本的平均值，每组三个平行。统计学意义*表示与相应的control相比p0.05和***p0.。统计学意义++表示与SFN给药组相比p0.01。

4.SFN与IP3R对NRF2蛋白和细胞凋亡的影响

图4：细胞中用萝卜硫素（SFN）、IP3R阻断剂（block）或两者联用-SFN和阻断剂（







































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