循环肿瘤细胞和播散肿瘤细胞在判断卵巢癌患

黄文倩摘译张师前审校

卵巢癌的主要扩散途径是腹腔内直接播散，有研究报道，在卵巢癌患者的骨髓中存在着播散肿瘤细胞（disseminatedtumorcells，DTCs）。然而，骨髓检查作为一种侵入性检查，并没有被广泛的应用于临床治疗中。近年来，外周血内循环肿瘤细胞（circulatingtumorcells，CTCs）越来越受到人们的重视。CTCs是由原发肿瘤脱落、释放并进入血液循环的肿瘤细胞，可以转移至其他器官，并在新的微环境中继续生长。正因为具有这样的特点，CTCs被认为是导致肿瘤的局限性或系统性复发的潜在因素。而无论是CTCs还是DTCs，在判断患者预后和监测治疗效果方面都有巨大的潜力。据报道，循环中的CTCs可见于乳腺癌、肺癌、肾癌、食管癌、肝癌、前列腺癌和胰腺癌等一系列实质性肿瘤中。在探究CTCs和DTCs与卵巢癌患者的关系的一系列研究中，大多数研究结果显示CTCs或DTCs与不良临床结局相关。部分研究没有找到二者之间的正相关关系，甚至声称其与无进展生存率/无病生存率以及总生存期呈负相关的关系。在卵巢癌患者中，CTCs/DTCs的诊断价值仍然存在着很大的争议。最近的一篇关于CTCs和DTCs与卵巢癌患者的关系的系统综述中称CTCs和DTCs与不利的临床病理学特点和不良临床结果显著相关，但是并没有提供具体的分析方法和合适的统计学数据。

本研究的主要目的是运用meta分析的方法，针对已发表的CTCs和DTCs与卵巢癌关系的临床研究进行分析，探讨CTCs和DTCs与临床结局之间的关系。

方法

基于pubmed和embase数据库中的文献进行了独立的系统回顾。检索策略：关键词包括“卵巢癌”、“卵巢上皮癌”、“循环肿瘤细胞”、“播散肿瘤细胞”和“预后”。只收录发表在同行评议期刊中的文献，排除快报和会议摘要。

对于合格的研究，记录如下信息：作者姓名、发布年份、参与者人数、CTCs和DTCs的取样时间、方法和结果、总生存期、无进展生存期/无病生存期。同时收集病理结果、淋巴结转移、分期、残留病变和治疗效果等临床病理学参数。卵巢癌的组织学分型主要分为浆液性癌和非浆液性癌。淋巴结转移通过细胞减灭术中收集的淋巴结病理切片结果确诊。根据卵巢癌的FIGO分型，将Ⅰ期与Ⅱ期合并，Ⅲ期与Ⅳ期合并。对于完全切除，不残留肿瘤组织的，称为无残留病变；残留肿瘤组织小于25px的称为微小残留病变；残留肿瘤组织大于25px称为肉眼残留病变。治疗效果根据患者对铂类的敏感性分为两类，在使用一线铂类药物化学治疗中，无铂间期≥6个月的患者称为铂敏感型，在化疗结束后6个月之内复发的称为铂耐受型。

纳入标准：（1）使用各种方法进行CTCs/DTCs测量的临床研究，包括随机对照研究、前瞻性研究和回顾性研究。（2）结果中提供临床结果和病理学结果。（3）提供OS或PFS/DFS作为存活指标。排除标准：（1）没有临床结果的实验室研究。（2）综述、社论和评论性文章。（3）没有存活指标或数据不足以提取。检索出的文献由两位独立的审稿人分别筛查标题和摘要，合格文章纳入meta分析，并进一步检索全文和提取数据。

根据群组研究中文献质量评价量表（NOS）对文献进行质量评价后，根据PRISMA和MOOSE声明进行meta分析。目的是分析CTCs和DTCs与临床病理学结果的相关性，结果用比值比（OR）表示。生存分析计算相对危险度的对数（lnHR）和标准误（SE）作为指标。如果lnHR、SE和P值在文中没有明确给出，则根据现有的数据或Kaplan-Meier生存曲线计算。对于生存期，使用固定或随机效应模型计算合并危险度（HR）和95%可信区间（CI）。异质性检验通过CMH检验和Q检验得出P值，当P值小于0.05时使用随机效应模型，当P值大于0.05时使用固定效应模型。对不同的样本类型和检验方法进行亚组分析。对于发表偏倚，绘制漏斗图，并进行Begg’s检验和Egger’s检验。统计学分析采用R软件metafor程序包（版本2.14.0）进行分析，P值小于0.05则认为有显著性差别。

结果

文献检索选入文献篇，经过标题和摘要的筛查，排除文献篇，包括91篇无关文献，33篇综述，4篇快报/评论/调查，89篇会议报告和23篇重复发表的文献。最终，对16篇符合纳入标准的文献进行数据提取，包括作者姓名、发布年份、参与者人数、CTCs和DTCs的取样时间、方法和结果、总生存期、无进展生存期/无病生存期和研究结果。

共有名患者纳入研究，每篇文献的样本量从43到不等。大多数文献发表于年至年之间，其中4篇来自美国，11篇来自欧洲，1篇来自亚洲。6项病例数共的研究评价了检测自骨髓的DTCs的预后价值，10项病例数共例的研究评价了外周血检测到的CTCs的预后价值。在最终纳入的16篇文献中，7篇对于CTC和DTC的预后价值的研究得到了阳性结果，4篇得到阴性结果，剩余5篇文献结果尚有争议。

分析CTCs和DTCs与病理生理学参数间的相关性，其中6篇病理诊断为浆液性癌或非浆液性癌的研究，探究CTCs和DTCs与卵巢癌组织学分型之间的关系。估计合并OR值为0.72(95%CI:0.48–1.06;Z=?1.71;P=0.固定效应模型)，说明CTCs与肿瘤的组织学分型无关。各研究之间间异质性不显著(Q=5.24,p=0.)。分析其中3篇评价是否发生淋巴结转移的研究，探究CTCs和DTCs与淋巴结转移间的关系。结果表明CTCs和DTCs与卵巢癌患者淋巴结转移并无显著相关关系（合并OR=1.14;95%CI:0.67–1.93;Z=0.;P=0.固定效应模型）。异质性检验结果不显著（Q=3.82,p=0.）。在6篇文献中，CTC与晚期癌症显著相关(III-IV期,合并OR=1.90;95%CI:1.02–3.56;Z=2.02;P=0.固定效应模型)，表明随着卵巢癌进展的风险的升高，CTCs和DTCs水平显著增高。异质性检验结果不显著(Q=10.84,p=0.)。三篇文献研究了CTCs/DTCs和肿瘤手术结局间的关系，CTCs与卵巢癌患者理想手术和非理想手术无显著相关性(合并OR=1.45;95%CI:0.90–2.34;Z=1.53;P=0.固定效应模型)。而一篇文献表明DTCs与残留病变显著相关(OR=2.31,CI:1.19-4.50)。异质性检测无显著相关(Q=3.71,p=0.)。两篇文献评估了铂敏感型和铂抵抗型患者CTCs与治疗效果间的关系，结果显示CTCs与卵巢癌患者的治疗效果显著相关(合并OR=0.55;95%CI:0.34–0.90;Z=?2.37;P=0.固定效应)，异质性检验无显著相关(Q=0.,p=1.)。

7篇文献分析了总生存期，共包括例病例。由于异质性检验P值大于0.05(Q=3.3,P=0.)，选择固定效应模型计算合并HR，得到的合并HR值显示CTCs/DTCs与总生存期显著相关(HR=1.94;95%CI:1.56–2.40;Z=6.02;P0.固定效应模型)。表明CTCs/DTCs显著地增加了卵巢癌的总死亡率。

7篇文献分析了无进展生存期和无病生存期，共包括例病例。异质性检验P值大于0.05(Q=3.3,P=0.)，选择固定效应模型计算合并HR值。估计合并HR值显示CTCs/DTCs同样与无进展生存期和无病生存期显著相关(HR=1.99;95%CI:1.59–2.50;Z=6.01;P0.固定效应模型)，表明CTCs/DTCs显著增加了卵巢癌患者生存率低的风险。

亚组分析的结果，CTCs在外周血中被检测到，而DTCs在骨髓中被检测到。将文献分为CTCs和DTCs两个亚组，探究采样类型对卵巢癌患者生存率的影响。分别有4篇文献和5篇文献检测并探究了外周血CTCs与PFS/DFS或OS间的关系，结果显示CTCs与PFS/DFS(HR=2.52[1.83,3.48],z=5.%,p0.)和OS(HR=1.97[1.50,2.58],z=4.,p0.)均显著相关。3篇文献检测了骨髓中DTCs，并探究其与PFS/DFS和OS间的关系。结果显示DTCs与PFS/DFS显著相关(n=2,HR=1.60[1.17,2.19],z=2.,p0.)和OS(n=2,HR=1.89[1.33,2.68],z=2.,p0.)。这些结果提示CTCs和DTCs可以成为卵巢癌患者预后估计的手段之一。

4篇文献运用RT-PCR的方法检测CTC，11篇文献通过循环肿瘤细胞检测系统或其他免疫组织化学方法检测CTC。对此，将文献分为分子基础和免疫基础的检测手段进行亚组分析。对于分子基础检测亚组，在3篇文献中，总生存期的HR和95%可信区间为1.78[1.24,2.54](z=3.,p0.)。而在另外两篇文献中PFS/DFS的HR和95%可信区间为3.49[1.95,6.24](z=4.,p0.)。对于免疫基础检测亚组的三篇文献中，总生存期的HR和95%可信区间为1.96[1.48,2.60](z=3.,p0.)，PFS/DFS的HR和95%可信区间为1.70[1.33,2.19](z=4.,p0.)。结果证明无论是RT-PCT还是免疫组织化学方法均可以用来检测CTCs/DTCs并预测患者生存期。

绘制Begg’s漏斗图来检验每一篇文献效应量与其标准差是否有相关关系。图像结果显示对OS的总体分析并没有不对称性(p=0.)。同时对于PFS/DFS的总体分析亦无不对称性(p=0.)。使用Egger’s检验，结果对于OS的总体分析并无明显的发表偏倚(p=0.)，但是在对PFS/DFS的总体分析中发现显著的发表偏倚(p=0.)。后续的亚组分析不存在发表偏倚。

讨论

通过系统回顾和meta分析，证实了CTCs/DTCs与卵巢癌临床晚期、预后不良和治疗效果均有显著的关联。在PFS/DFS分组中，尽管Pearletal.和Kuhlmannetal.存在发表偏倚，在偏倚消除后，CTCs和DTCs仍与PFS/DFS显著相关。对于CTCs/DTCs与OS和PFS/DFS的合并HR值接近2.0，证明CTCs/DTCs对生存期的评价有很强的预测价值。单项CTCs对PFS/DFS的合并HR值大于2.0，说明CTCs可以用来作为卵巢癌的预后标志物。

分析CTCs和DTCs与卵巢癌患者的临床病理学特征，发现CTCs和DTCs与癌症晚期和化疗效果显著相关，而与组织学分型、肿瘤切除程度和淋巴结是否转移无显著相关性。同时，有研究报道，外周血中检测到CTCs与癌症晚期显著相关，这可能是患者在手术切除后仍有高复发率的原因之一。有报道称在肿瘤细胞减灭术后有残留病变的卵巢癌患者预后差。此外，在对化疗药物的治疗效果方面，CTCs和DTCs与治疗效果显著相关。这说明CTCs和DTCs可以作为早期指标预测卵巢癌需化疗的治疗效果。根据meta分析，外周血中检测到CTC与满意手术或非满意手术无显著相关，只有一篇文献认为骨髓DTC与残留病变呈正相关(OR=2.31[1.19-4.50])。对于这个问题，需要更多对于卵巢癌与CTCs的相关性研究来证实其临床价值。另一方面，卵巢癌的主要转移方式是腹腔内直接播散，只有癌灶侵袭淋巴管时才会发生淋巴结转移，而只有癌灶侵袭血管时，CTCs和DTCs才可以在患者体内被检测出。所以淋巴结转移和CTCs/DTCs均与卵巢癌患者预后不良相关，但是CTCs/DTCs与淋巴结转移并无显显著相关性，说明或可存在其他播散与转移方式。

在亚组分析中，CTCs对PFS/DFS的HR值大于DTCs对PFS/DFS的HR值（2.50vs1.60），而CTCs对OS的HR值与DTCs对OS的HR值相似（1.97vs1.89）。说明在评估肿瘤进展方面，CTCs比DTCs更为敏感。除此之外，在检测肿瘤进展时，CTCs的检测方法操作性比DTCs更强。虽然骨髓是转移的主要部位，但是外周血中的CTCs更容易系统地评估。CTCs和DTCs的检测方法主要有RT-PCR和免疫组织化学两种方法，二者均与预后不良显著相关。与免疫组织化学相比，RT-PCR敏感性更高(HR3.49vs1.70)。这说明RT-PCR是卵巢癌患者体内CTC/DTC检测的可靠方法。但是目前仍存在着许多问题，如假阳性和假阴性率高和难以定量测量等。尽管有报道从外周血中游离DNA片段检测的方法，最近甚至扩展至全基因组检测，但是通过荧光原位杂交法（FISH）进行原位形态学分析和免疫组织化学是不可能实现的。除了对CTC进行核酸检测，还可以利用CTC的物理性质，包括细胞大小、细胞密度、膜电位和迁徙性来与正常血液细胞分离并检测，特别适用于检测外周血循环中具有完整功能的癌细胞。这种方法在CTC检测中具有应用前景，但是还需要进一步的研究证实其效果。

在本研究中，CTCs和DTCs与不良的生存结局显著相关。但meta分析存在一定局限性。首先，文献中的样本量相对较少，有说服力的结果应通过大型前瞻性临床试验得出。其次，不同研究间的方法学差异导致试验设计、检测手段和CTCs/DTCs阳性指标中存在异质性。迄今为止，CTCs和DTCs的检测并没有明确的阳性标准，缺乏有效性研究。在未来的临床试验中，需要一个国际通用的定义“CTCs阳性”的指标。第三，logHR和SE结果分别来自多因素分析和单因素分析，为了数据的完整，研究中将多因素分析与单因素分析进行了合并。

结论

大量证据支持在卵巢癌患者中，CTCs和DTCs与肿瘤晚期、残留病变和化疗效果显著相关，但是与组织学分型、淋巴结转移并无显著相关。此外，CTCs同样与较低的存活率显著相关，所以，CTCs和DTCs是卵巢癌可靠的非侵入性预后指标。基于CTCs和DTCs，可以对卵巢癌患者能否在化疗中取得良好的治疗效果作出临床推断。

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