卵巢癌肿瘤细胞减灭术为什么会达不到满意，

摘要目的晚期上皮性卵巢癌不满意的肿瘤细胞减灭术会导致不良预后，这种不良的结局是不可切除肿瘤的固有生物学特征？还是不满意的外科手术导致肿瘤克隆的残存所致？本研究的目的是探讨不满意手术切除的肿瘤分子途径和细胞类型。方法通过比较满意和不满意肿瘤细胞减灭术患者的基因表达，确定和不满意肿瘤细胞减灭术相关的基因网络，探索与该基因网络相关的生物学过程和细胞类型。结果不满意肿瘤细胞减灭术患者表现为独特的分子亚型，特点是活化间质细胞和淋巴脉管浸润，类似的分子途径也出现在卵巢癌转移瘤中，这表明不满意肿瘤细胞减灭术原发肿瘤的生物学行为类似转移瘤，同时其基因网络中富含反应性肿瘤间质细胞，而不是恶性肿瘤细胞。结论肿瘤细胞减灭术是否成功取决于肿瘤自身的生物学特性，如广泛的间质反应和侵袭性增加，这可能会影响手术切除，并最终导致较低的生存率。

1.前言

上皮性卵巢癌（EOC）多属晚期，存在广泛腹腔内扩散，标准治疗为肿瘤细胞减灭术，并辅助铂类和紫杉醇化疗。研究表明癌灶残留与预后相关[1,2]。如果患者存在要害器官转移病灶很难达到R0，最好选择放弃PDS，行新辅助化疗来降低肿瘤负荷，通过IDS达到完全切除的目的。但目前尚没有合适的生物学标志预测不满意的肿瘤细胞减灭术[1,2]，已经开展的几项评估手段，包括CT、血清CA以及腹腔镜探查，但并没有足够的特异度和/或灵敏度达到临床决策要求[3-9]。

导致不满意肿瘤细胞减灭术患者不良结局的原因不得而知，目前存在两种理论：1.残存的肿瘤细胞数量决定肿瘤生长速度以及化疗的有效性。具体而言，肿瘤细胞减灭术可减少肿瘤负荷或抵抗克隆，延迟化疗耐药，切除大量坏死组织可能会增加药物输送到小的、乏氧的肿瘤组织，残存的微小病灶大多为增殖细胞，有较高的化疗敏感性，切除特殊部位的肿瘤（比如容易造成肠梗阻的肿瘤）能改善患者的整体状况和免疫功能等。2.肿瘤内在的侵袭性特征可造成手术失败、化疗抵抗、快速增长及侵袭性强等。如果不可切除肿瘤的生物学行为与可切除肿瘤不同，那么它们就可能具有不同的分子特征。最近两项研究用表达谱数据来区分不满意肿瘤细胞减灭术肿瘤的分子特征[11,12]，虽然利用不同的数据和参数，但是合成的基因特征大部分是重叠的，呈现出相同的生物学过程，如细胞外基质重塑、侵袭和血管再生等[11,12]，而这些过程和EOC的进展与转移相关，表明肿瘤细胞减灭术的成功与否取决于肿瘤的生物学特征。本研究旨在分析不满意肿瘤细胞减灭术的分子途径，来确定可能决定手术结局和疗效的潜在生物学过程。

2.材料和方法

2.1.数据库和患者入组标准卵巢癌基因表达的三大数据库为TCGA，GSE[13]，和GSE[14]，肿瘤细胞减灭术的信息可以从卵巢数据库R下载[15]。数据库中的所有数据经过预处理，在基因水平上进行标准化。本研究限制在原发、晚期卵巢浆液性癌，低级别EOC、非浆液性EOC、转移性肿瘤或其他疾病均被排除。这三大数据库分别有，，例患者，其中有，93，66例为不满意肿瘤细胞减灭术患者，TCGA和GSE数据库被用来确定分子标记，而GSE数据库用于验证这些分子标记和评估预测能力。

2.2.统计分析策略候选基因是根据差异表达基因和差异基因网络来确定。首先，两个数据库（TCGA和GSE）标准化表达谱是从不满意和满意肿瘤细胞减灭术患者的差异表达基因中筛选的，每个数据库分别采用双样本t检验，P≤0.05有统计学意义。两个数据库中获得共同的差异表达基因被合并在一起，用于建立共同和差异基因网[16,17]，从差异基因网中筛选出候选基因标记，并通过不相关的数据库进行验证（GSE）。

2.3.多变量模型和验证指标应用不相关的数据库GSE分别验证这些候选基因，多变量逻辑回归和双侧t-tst用于确定基因在验证数据集表达式的值。ROC和AUC被用来评估所确定基因标记的预测能力。MATLAB统计工具被用来进行多变量逻辑回归模型和AUC评估。

2.5.公共表达谱数据集分析R2基因组学分析和可视化平台(hgsrvr1.amc.nl/)用于不同组的基因表达进行可视化比较。

2.6.人体组织标本留存人体组织标本和组织化学染色方法在文献中已描述[20]。

3.结果

3.1.不满意肿瘤细胞减灭术相关的基因网络(SCAN)

不满意和满意肿瘤细胞减灭术患者的基因标记通过差异基因和差异基因-基因相互作用来确定。卵巢癌不只是单个基因突变导致的分子网络失调，不同临床状态下的基因变化及相互作用与肿瘤细胞减灭状态有关。因此，我们采用一种新颖的方法［16,17］，结合不满意和满意肿瘤细胞减灭术患者的差异基因表达和差异网络结构来进行基因选择[15]。首先利用两样本ｔ检验分别对TCGA和GSE数据库中满意和不满意肿瘤细胞减灭术患者的基因表达水平进行比较，从TCGA选出个差异表达基因，GSE中选出个差异表达基因，然后合并这两组数据，利用稀疏图形模型建立共同和差异表达网络[17]，筛选出11个差异表达基为候选基因标记-SCAN基因，基于蛋白质间相互作用（PPI）网络分析，SCAN基因可能形成一个生物功能网络，利用差分网络方法确定不满意肿瘤细胞减灭术相关基因的功效，通过差分网络来比较这11个SCAN基因功能的表达，通过Studnt’st检验在不相关的数据库GSE进行验证。这11个SCAN基因在验证数据库中的P值都很低，P值最低的4个SCAN基因(POSTN,FAP,TIMP3,COL11A1)的预测功能分别通过Logistic回归和ROC曲线下面积（AUC）进行评估。我们发现4个P值最低的SCAN基因的转录水平与TCGA和GSE数据库中残存病灶的量相关。

3.2.SCAN基因在卵巢癌不同分子亚型中的表达

为确定SCAN基因是否与卵巢癌分子亚型有关，我们采用的数据来自两项综合性研究，根据表达谱确定卵巢癌不同的分子亚型[14,21]。在Vrhaak研究中高级别浆液性癌在TCGA数据集分为4个分子亚型（分化行型、免疫反应型、间质型、增生型）[21]，在Tothill研究中例浆液性和子宫内膜样卵巢癌分为6个分子亚型（标记为C1-C6）[14]，浆液性主要为C1-C5亚型，C6亚型见于子宫内膜样癌[14]。为了确定SCAN是否集中在这些分子亚型中，我们检测了11种SCAN基因在这些分子亚型中的表达，结果显示：SCAN基因在TCGA数据集中间质型高表达，在Tothill数据集中C1亚型中高表达。值得注意的是Tothill数据集中C1亚型与广泛的结缔组织增生和不良预后相关，而在TCGA数据集中的间质型分子亚型也与不良预后相关[22,23]。因此，SCAN基因和特定分子亚型有关，其特点是纤维组织增生和/或出现间充质细胞，预后不良。

3.3.SCAN基因在侵袭性和转移性卵巢癌中高表达

4个SCAN基因中确定3个（POSTN、TIMP3、COL11A1）为预后不良的基因标记，在转移灶中表达上调[20,24]。为了确定和转移相关的基因标记，我们利用两个微阵列数据库：Bignotti（17例转移，13例原发性卵巢癌）和GSE（匹配9例大网膜转移和原发性卵巢癌），比较大网膜转移灶和原发灶的表达谱[25]，发现SCAN基因在大网膜转移灶中高表达，11种SCAN基因中有5种出现在转移灶中，SCAN基因在淋巴或血管浸润的患者中高表达，说明不满意肿瘤细胞减灭术可能与卵巢癌侵袭/转移的特质有关。

3.4.SCAN基因在肿瘤间质中表达增加，而不是恶性细胞

基因集富集分析（GSEA）发现：与SCAN基因表达相关的最有意义的标志基因可辅助“上皮间质转化（EMT）”，在伤口愈合、纤维化和转移过程中发挥作用（P=6.72?10），而“细胞外间质（ECM）”被确定为最有可能的蛋白表达位点（P=6.34?9）。

恶性肿瘤上皮细胞和间质细胞都可以分泌ECM，为了明确哪种细胞类型表达SCAN基因，我们使用GSE表达谱数据库对来源于正常卵巢和卵巢癌上皮细胞和间质细胞中的SCAN基因表达水平进行了评估，结果表明：SCAN基因在肿瘤相关间质中表达最高[26]。为了测试SCAN基因是否富集于恶性肿瘤细胞中，我们在CCLE按照SCAN基因的表达水平对例肿瘤细胞株进行排序，排在最前面的是原代细胞，间质细胞是原代细胞培养中的“污染物”，表现为成纤维细胞形态，也有可能表达SCAN基因，排在最前面的卵巢癌细胞株HST(rank55)是来自NBL的近传代细胞株，而在原代卵巢癌细胞株中排名最靠前的是TOVD（rank83）和A（rank），二者归类于间质细胞[27]。

先前的研究表明SCAN基因COL11A1主要在肿瘤间质中表达，在肿瘤进展过程中随着间质细胞的增加而表达增加[20]；一些SCAN基因（包括POSTN，TIMP3、COL11A1）在卵巢癌发展过程中富集在间质细胞而非上皮成分，在复发灶中表达最高[28]；因此，转移灶和复发灶中SCAN基因表达增加可能反映了间质细胞比例增加，恶性肿瘤细胞比例减少，为了验证这一假设，我们比较了SCAN基因、间质细胞标记物VIM表达水平，发现转移灶中VIM表达增加，SCAN基因变化不明显，所以SCAN基因在转移灶中表达增加不能单单解释为间质细胞比例增加。另外，在肿瘤进展过程中SCAN基因表达增加也反映了肿瘤间质性质的改变，研究证实上皮性肿瘤的进展与结缔组织增生或活性间质成份增加有关[29]，活性间质的特点是ECM成份重塑增加，产生α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)[29]，我们发现SCAN基因表达与活性间质标记物ACTA2表达一致，同样COL11A1基因也在α-SMA阳性的卵巢癌中表达，均说明SCAN基因表达和肿瘤活性间质相关。

4.讨论

晚期EOC患者行不满意肿瘤细胞减灭术导致生存不良，但不良结局是不可切除肿瘤的特质，还是手术切除不足所致，目前不得而知，临床上还没有可用的预测手术成功的模型，因此需要了解肿瘤生物学特性对手术结局的影响。最近两项研究使用不同统计学方法在TCGA、GSE、GSE数据库中确定不满意肿瘤细胞减灭术的基因标记[11,12]，11个SCAN基因中有6个（POSTN，FAP，TIMP3CTSK，TNFAIP6，和CXCL14）在Ristr确定的个不满意肿瘤细胞减灭术相关基因标记中列前位，有3个（FAP，TIMP3、COL11A1）出现在Tuckr确定的38个残存灶相关基因标志中。SCAN基因预测的精确度类似于Ristr[12]和Tuckr[11]确定的基因标记的精确度，虽然这些分子标志很难达到临床可用的预测精确度，但密切不满意肿瘤细胞减灭术相关的基因标记，可能有助于揭示残留病灶生物学行为的重要信息。

本研究的目的是确定和不满意肿瘤细胞减灭术相关的生物学通路和细胞类型，如果肿瘤的生物学行为能够决定手术能否成功，那么EOC分子亚型可能和手术结局相关。事实上，TOTHILL研究中大部分C1亚型患者有大量残存灶，本研究也证实不满意肿瘤细胞减灭术相关的基因标记在C1/间质亚型EOC患者中高表达，SCAN基因在侵袭和转移肿瘤中高表达，表明C1/间质亚型原发瘤的生物学行为类似于转移瘤，由卵巢自我转移所致。

我们通过基因集富集分析确定EMT是SCAN基因相关的有意义的标志，研究表明上皮细胞可以通过EMT产生肿瘤间质[30,31]；但最近两项关于结直肠癌的研究证实人类结直肠癌中的EMT基因标记来自于肿瘤相关间质，而不是恶性肿瘤细胞转化的间质表型[32,33]；Islla通过人移植瘤模型（PDX）研究发现上皮性肿瘤细胞可在小鼠体内继续繁殖，而间质细胞死亡，特异性RNA测序证实PDX中人类间充质基因标记减少，从分子特征上看EMT来自人类肿瘤的间质细胞[32]；Callon采用流式细胞术分离人类原发肿瘤的上皮细胞和成纤维细胞，发现间质分子标记富含在肿瘤成纤维细胞中[33]。这两项研究得出的共同的结论是：EMT分子标记来源于间质细胞。SCAN基因标记，尤其是和大肠癌重叠的EMT分子标记也来源于EOC的肿瘤间质，肿瘤微环境在EOC发生发展中发挥重要作用[34,35]。

本研究结果表明间质活化可能影响手术结局，手术预后相关的生物标志物检测有利于晚期患者治疗方案的选择，使这些患者从新辅助化疗中获益，可能也是妨碍手术彻底性，化疗反应较差的晚期卵巢癌共同的生物学特征，例如位居前三的SCAN基因（POSTN，FAP，和TIMP3）也被确定为EOC耐药相关的基因前三位[28]，提示伴有残存灶的EOC患者也可能抵抗新辅助化疗；11个SCAN基因中有5个(POSTN,FAP,CTSK,COL5A2,andMMP11)被包含在乳腺癌抵抗新辅助化疗（包括氟尿嘧啶、表阿霉素和环磷酰胺）的50个基因标志中[36]，Farmr研究认为乳腺癌化疗耐药与结缔组织增加有关，表明活化间质的存在可能导致多药耐药或限制了化疗反应通路。因此，有必要在化疗前或化疗时，靶向活化肿瘤间质，以达到满意疗效。

肿瘤的间质活化与间质纤维化重塑有许多相似之处，活化间质有助于手术的成功，这个靶向治疗过程已被广泛研究，虽然目前还没有FDA批准的用于治疗器官纤维化的药物，但大量的合成物逆转纤维化已取得了进展，并应用于临床试验[37]，我们设想利用这些药物逆转肿瘤间质活化，以达到治疗的目的，提高手术和化疗的疗效。

译自：Suboptimalcytorductioninovariancarcinomaisassociatdwithmolcularpathwayscharactristicofincrasdstromalactivation.GyncologicOncology.;:-

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