利用二代测序技术检测石蜡包埋中的卵巢癌B

研究背景

BRCA突变的卵巢癌患者对铂类治疗和最近新批准的PARP抑制剂有很好的应答。PARP-1蛋白对于修复DNA单链断裂是非常重要的，在有缺陷的同源重组细胞中，如BRCA突变携带者，PARP-1抑制合成是致命的，会导致细胞周期阻滞和随后的细胞凋亡。年12月欧洲药品局(EMA)和美国食品和药物管理局(FDA)批准了PARP抑制剂olaparib(奥拉帕尼)用于治疗卵巢癌BRCA1和BRCA2突变。因此应用及时高效地商用检测技术检测福尔马林固定石蜡包埋组织的体细胞突变和种系突变(生殖系突变)是非常必要的。本研究旨在评估在日常的BRCA诊断分析中使用NGS技术的可行性。

研究方法

通过使用商用试剂盒和NGS测序技术探索47例高水平浆液卵巢癌FFPE样本的BRCA1和BRCA2基因的所有外显子和50bp的外显子-内含子交接区的突变情况，所有突变再通过Sangr测序对比确认。应用callability分析检测ClinVar和COSMIC数据库中个BRCA1和BRCA2变异类型来评估NGS的检测能力和NGSpanl的性能。

研究结果

表1为报道的NGS目标测序结果，图1为其中的一个举例。所有样本中的DNA都成功的扩增出来，得到足够的适于NGS的文库。平均读长为bp，平均覆盖率为?，99.6%的目标碱基覆盖程度超过?。

表1利用二代测序技术发现的47例卵巢癌患者中BRCA1/2基因中的致病突变

*?这种突变没有被记录在ClinVar中，但是在相同的密码子处有一个变异，ClinVar变异：c.CG(p.ProArg,rs)被记录为致病变异

**??这种变异在dbSNP和ClinVar都没有记录，但是它们引起了密码子的过早终止，它是致病突变的一个特征。

致病变异：

在47例卵巢癌样本中发现13个BRCA致病变异(8个BRCA1和5个BRCA2)(表1)。8个BRCA1基因变异中，5个移码突变导致出现过早的终止密码子，1个无意突变，1个框内单独密码子丢失，1个错义突变。移码突变、无意突变、框内缺失作为致病突变被记录在ClinVar数据库中。发现的唯一的错义突变(c.CT;p.ProLu)没有记录在数据库内，但另1个致病错义突变(c.CG;p.ProArg)是被记录在ClinVar数据库中的（表1）。通过对比分析匹配的正常组织DNA评估所有的BRCA1突变均为种系突变。5个BRCA2基因变异中，4个移码突变（3个缺失，1个插入）导致出现过早的密码子终止和1个无意突变。通过对比分析匹配的正常组织DNA评估所有的BRCA2突变中有3个是体细胞突变，2个是种系突变（表1）。1个体细胞突变(c._dlCT)和1个种系突变(c.dupA)作为致病突变被记录在ClinVar数据库中，其余另外2个体细胞突变和1个种系突变没有记录在数据库内，但是由于它们可以引起过早的终止密码子出现（致病突变的一个特性）被认为是致病突变。上述所有变异类型均通过Sangr测序得到确证（图1），因此评估特异性是%。

图1利用带有HR1试剂盒的二代测序技术检测突变并通过Sangr测序验证的一个代表性例子。左侧图片是原发性卵巢癌（经HE染色）的组织切片，对细胞区域最多的地方进行显微切割准备DNA样本。中间图片表示利用IGV软件将二代测序结果与参考基因组序列进行对比后得到的结果对比图（红色为正向，蓝色为反向）。右侧图片表示利用Sangr测序对每一个癌症进行突变验证（A、B、D为正向测序，C为反向测序）。在A、B中的BRCA1突变和在D中的BRCA2突变在肿瘤组织中是纯合的，如同在IGV和Sangr测序中表现出来的一样。这些突变在各自患者的种系DNA中是杂合子。C中的BRCA2突变在肿瘤组织中是杂合的，它的体细胞突变通过与正常DNA对比后得到确认（未显示）

额外的变异：

在2个病例的BRCA1基因中，发现一个额外的种系变异c.GA(p.SrAsn)，在ClinVar数据库中有8位提交者把这个变异记录为良性变异或可能是良性变异，1位提交者记录为不确定，另外一位记录为致病变异。在千人基因组数据库，这个变异在全球人口中的突变频率是1%。在29个患者的BRCA2基因中检测到2个种系单核苷酸多态性（SNP），24个患者携带c.AC(p.AsnHis)SNP，3个患者携带c.AC(p.AsnHis)SNP，另外2个患者两种变异均携带。第一种SNP，c.AC(p.AsnHis)，在ClinVar数据库中有4位提交者把它记录为良性变异，1位把它记录为致病变异；在千人基因组数据库，它在全球人口中的突变频率是25%。第2种SNP，c.AC(p.AsnHis)，有7人把它记录为良性，在全球人口中的突变频率是7%。

TargtdNGS的灵敏度

为了评估NGSPanl的表现，我们检测了BRCA1和BRCA2的个变异，包括ClinVar数据库中的个种系变异和COSMIC数据库中的个体细胞突变，其中的个是重叠的（表2）。分析表明：HR1NGS-kit试剂盒获得了这些变异中的（87.1%）个明确的DNA区域，可以通过VariantCallrPlugin软件(TorrntSuitSoftwarv4.6;LifTchnologis)自动识别，但是自动识别隐匿区域内的（12.9%）个变异是有挑战的。其中（12%）个变异虽然可以被软件自动鉴别，但由于它们接近延长的聚合物或人工产物可信度较低，因此需要使用IntgrativGnomicsViwr(IGV)v2.3(BroadInstitut)软件进行该区域内的确认/校正。具体来说，需要确认的变异数量是个BRCA1和个BRCA2。剩余65（0.9%）个变异是不可调用的。这个65个变异中，其中13（0.2%）个是位于延长的聚合物上的碱基单/双插入或缺失，1个BRCA1和12个BRCA2通过软件和校正检测均不足以辨别是人工产物还是一个真正的突变。余下的位于BRCA2区域的52（0.7%）个变异，利用目前的NGS文库途径从FFPE组织中扩增出来是非常困难的，因此没有从HR1panl中扩增出来。不可调用的15个变异通过Sangr测序得到解决（表2）。总之，NGS测序对BRCA1和BRCA2的敏感度是99.1%。

表2HR1Nxt-Gnrationkit与Sangr测序在体细胞和种系BRCA突变的callability分析对比情况

callability分析使用TorrntVariantCallr

*种系变异列在ClinVar数据库中，突变列在COSMIC数据库中。总的变异数量少于数据库（）

中的数量（由于存在个变异重叠）

s评估基于使用福尔马林固定包埋组织中的DNA，每个反应bp（如果每个外显子bp）

**序列的可视化验证使用IGV2.3软件

***基因中延伸的聚合物和人工产物突变没有包含在NGS的panl中。通过Sangr测序解决的65个盲点中有1个BRCA1突变和14个BRCA2突变

研究结论

研究表明，利用商业试剂盒(HR1,4Bass)的二代测序技术可检测来源于FFPE组织样本的BRCA1和BRCA2的体细胞突变和种系突变是非常高效的。

信息来源：

AndraMafficini1,MichlSimbolo1.tal.BRCAsomaticandgrmlinmutationdtctioninparaffinmbdddovariancancrsbynxt-gnrationsquncing.Oncotargt,.