备受行业大咖青睐的CARNK,如何在肿

随着科学界对免疫细胞更深入的探索，免疫细胞疗法不再仅仅局限于T细胞疗法，NK细胞在肿瘤治疗中的应用也在逐渐被挖掘。近日，临床阶段生物制药公司KiadisPharma宣布了NK细胞首次在白血病上的应用，首位复发/难治性急性髓细胞性白血病（r/rAML）患者已成功进行NK细胞给药！除此之外，包括FateTherapeutics、DragonflyTherapeutics、NkartaTherapeutics以及国内博生吉医药科技、科济生物、和珀医药等多家企业早已开始投入CAR-NK的研发中。01NK细胞变身CAR-NK细胞

自然杀伤细胞(naturalkillercell，NK)是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。

NK细胞因不同于T细胞的非特异性识靶及杀伤机制吸引科学家将工程CAR-T技术沿袭并用于CAR-NK改造。

无论在体外细胞模型还是小鼠动物模型中，CAR-NK均显示出良好的肿瘤杀伤效果。

已有临床研究显示，CAR-NK细胞对血液系统肿瘤有良好的治疗效果，但治疗实体瘤效果尚待验证。

其自身优点预示CAR-NK细胞在实体瘤治疗方面拥有良好的发展前景。

作为潜在免疫治疗靶点的主要NK细胞受体NK细胞从静止到激活的转变是由激活受体和抑制受体网络介导的。02CAR-NK优势

相较于CAR-T疗法，NK细胞作为效应细胞具有很多优良特性。

异体NK细胞不会引起移植物抗宿主反应（GVHD），并已在许多临床试验中得到证实。

NK细胞不分泌引起细胞因子释放综合征的炎症因子，如IL-1、IL-6。

CAR-NK细胞除了CAR介导的靶向杀伤之外，还可以通过NK细胞自身抗肿瘤的特性，识别并杀伤CAR靶标下调或缺失的肿瘤细胞，提高免疫治疗效果。

异体NK细胞的来源广泛：包括外周血、NK细胞系、脐带血、诱导多能干细胞、NK-92等细胞系。

对于实体瘤的治疗，研究人员开发了多种靶向肿瘤相关抗原的CAR-NK细胞，如靶向GD2、EGFR和PSCA等。

经过CAR修饰后的NK细胞对表达相应抗原的靶细胞展现出更强的细胞毒作用。其中，最为特别的是以NKG2D作为胞外域的CAR结构，NKG2D可以与多种肿瘤表面的配体结合，有广谱抗癌效果，NKG2D-DAP10-CD3ζ构建的CAR-NK细胞对于骨肉瘤、前列腺癌、横纹肌瘤等肿瘤有着良好的杀伤效果。

CAR-T细胞和CAR-NK细胞产品生产时间线

03CAR-NK在癌症治疗中的进展目前全球仅有14项涉及到CAR-NK的临床实验，其中有6个项目正在招募中（表1）。其中大部分试验集中在淋巴瘤和白血病，其它一些则针对实体瘤，包括卵巢癌、前列腺癌、脑癌、肝癌、肺癌和胰腺癌。

今年2月，德克萨斯大学M.D.安德森癌症中心的研究人员公布了美国首个CAR-NK细胞临床试验结果：用脐带血来源的CAR-NK疗法治疗非霍奇金淋巴瘤(NHL)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)后，大多数患者产生了临床响应且未出现严重的副作用。

表1.目前CAR-NK细胞相关的临床试验

博生吉医药科技（苏州）有限公司已有4项分别靶向CD19、CD7、CD33和MUC1的CAR-NK临床试验正在开展。

04CAR-NK在血液瘤中的疗效与进展

与CAR-T一样，CAR-NK也率先在血液肿瘤上开展。

●医院完成了第一个关于CAR-NK的临床Ⅰ期试验（NCT），这项研究使用靶向CD19的CAR-NK细胞治疗B系急性淋巴细胞白血病。

●Romanski等构建的NK-92-scFv（CD19）-CD3ζ可以增强对B细胞恶性肿瘤细胞的杀伤，并且可以克服NK细胞抑制现象。

●Boissel等构建的CD19/CD20―CAR-NK，注射入免疫缺陷小鼠创建的CLL病模中，肿瘤细胞得到了有效的清除起到了治疗效果，而且进行改造的CAR-NK依然可以发挥ADCC的作用。

●今年3月，NantKwest和ProMabBiotechnologies签署合作协议，在全球范围内建立一种最新的、高亲和力的、针对多发性骨髓瘤BCMA靶向抗体序列的CAR-NK细胞疗法。CAR的靶向序列选择最多可以达到5个。

●年9月3日，美国FDA已经批准了FateTherapeutics在研疗法FT的研究性新药(IND)申请。FT源自克隆主诱导多能干细胞(iPSC)系，是该公司首个现成的CAR-NK)细胞免疫疗法，可靶向多种肿瘤相关抗原。该公司计划启动FT单药及联合CD20单抗治疗B细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病的临床研究。

●年9月5日，Nkarta公司完成14亿美元B轮融资，该笔资金用以支持其针对B细胞恶性肿瘤CD19的CAR-NK项目的IND授权和临床试验。

05CAR-NK在实体瘤中的疗效与进展

CAR-T细胞在抗击实体肿瘤的过程中，由于PD-1的表达以及肿瘤细胞表面PD-L1的表达，导致出现免疫抑制现象。

NK细胞表面PD-1表达很低，相对受肿瘤微环境免疫抑制小，也许是抗击实体瘤的良好候选者。

目前，CAR-NK针对实体瘤的治疗逐渐展开。

Han等以CD28/CD3ζ为信号域融合EGFR抗原区构建的CAR-NK92细胞系，在体内外对胶质瘤取得了较强的杀伤效果。并且另有研究发现HER2-CAR修饰的NK92细胞对表达HER2阳性的乳腺癌以及卵巢癌细胞系有较强的杀伤作用，在体内也可以抑制肿瘤的生长。

用CD28/CD3ζ融合CS1改造CAR-NK对于CS1+的MM细胞有很强的杀伤能力，并且在体外还能促进IFN-γ的分泌。CS1-CAR-改造的NK-92细胞抑制MM肿瘤生长，并且延长荷瘤小鼠的生存周期。关于c-Met，FAB，GD2，WT1，PSMA，NY-ESO-1相关抗原改造的CAR-NK也有报道，均表现出不错的抗肿瘤效果。

在另一项使用PB-NK的研究中（NCT），广谱性CAR-NK（靶向NKG2D配体）已应用于临床，治疗多种转移性实体瘤。

●年1月26日，科济生物联合上海市肿瘤研究所、上海医院发表了第一篇靶向GPC3的CAR-NK治疗肝细胞癌的研究论文，研究结果显示：GPC3-CAR-NK细胞在体内外均能够特异性地靶向并杀伤表达GPC3的肝细胞肝癌，并且不受血清水平可溶性GPC3、实体瘤低氧环境和TGF-β的影响。

●年7月24日，阿思科力公布了CAR-NK治疗17例复发/难治晚期实体瘤患者的最新临床研究数据，（乳腺癌11例，肠癌3例，肺癌1例，胰腺癌1例，肝癌1例）数据显示，疾病控制率达到76.5%，患者总生存期大于20个月，且无一例重大不良事件发生。抗癌作用显著，安全性好。

06CAR-NK的挑战

目前的CAR是为构建CAR-T细胞而设计的，因此设计针对CAR-NK的CAR结构以达到激活NK细胞和细胞毒性的目的也是目前该领域的一个研究热点。

其次，逆转录病毒转染可能会诱发插入突变，慢病毒转导PB-NK细胞的效率较低。目前研究者正在探索一种使用非病毒载体的方法。此外，在NK细胞中，使用CRISPR/Cas9系统靶向CAR插入结合基因敲除为改进原代CAR-NK细胞产品提供了新的可能性。

使用细胞因子，如IL-2、IL-12、IL-15等对NK细胞进行体外扩增的能力有限，并且可能会导致扩增细胞对细胞因子的依赖性。目前研究者正在探索使用基于饲养层与细胞因子相结合的扩增方案。

由于NK细胞寿命有限，因此在输注后CAR-NK的持久性也是目前亟待解决的一个问题。

07最后，CAR-NK的来源有哪些

人胚胎干细胞

脐带血在体外分化扩增的NK细胞已经向临床转化。

年6月，MDAnderson癌症中心利用脐带血诱导分化出NK细胞，并进行嵌合抗原受体改造，用于治疗复发或者耐药性慢性淋巴细胞白血病（CLL），急性淋巴细胞白血病（ALL）或非霍奇金淋巴瘤已经进入临床Ⅰ、Ⅱ期阶段。

诱导多功能干细胞

iPSC衍生出的NK细胞同时拥有外周血NK细胞和NK细胞系的优点，它不仅性质均一可以大量扩增，而且无须辐照即可注入体内。iPSC可以轻易地从皮肤或外周血中获取，一旦转化后便可在体外无限扩增。

据加州大学研究报道，iPSC诱导分化而来的NK细胞在经过CAR改造后，可以抑制卵巢癌模型小鼠体内肿瘤的生长，并且延长荷瘤小鼠的生存周期。这种方式获得的NK细胞纯度较高，是一种较好的NK来源。

自体外周血来源

过去的十几年，在外周血中已经可以高效分离并扩增临床级NK细胞。这种方法获得的NK细胞已经用于急性髓细胞白血病（AML）的治疗试验。原代NK细胞的表面表达KIR，该受体是维持NK细胞功能的关键。因为异体移植的NK细胞与受体患者的HLA-Ⅰ类分子不相符，NK细胞会保持持久的杀伤效果。

目前已有多项关于外周血来源的CAR-NK细胞用于癌症免疫治疗的研究，其中靶向CD19最为突出，修饰后的CAR-NK细胞在急性B淋巴细胞白血病的治疗中具有十分理想的疗效。

作为一种相对安全且即用型的产品，CAR-NK为肿瘤免疫疗法带来了新的希望。

经过科学家们不懈的努力，未来CAR-NK疗法一定能成为癌症治疗一大强有力的工具！

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