卵巢透明细胞癌潜在的治疗方案

最近，医院和哈佛大学医学院的科学家们共同研究的结果揭示了卵巢透明细胞癌的可能治疗方案。该研究发表在CellReports上。

卵巢透明细胞癌（OCCC），约占所有卵巢上皮性细胞癌的10-15%。OCCC被认为是最具侵略性的癌症之一，恶性程度高，对于传统化疗药如紫杉醇或顺铂不敏感。Chan等对例美国卵巢癌患者进行分析发现，OCCC的发病率在亚裔人群中较白种人、黑种人更高（11.8%vs.4.8%vs.3.1%）。目前引起这种种族间的发病率差异的机制还不清楚。在OCCC中发现一种常见的ARID1A缺失突变，并经常与PIK3CA激活突变共存。该事实由Chandler等人于年通过转基因小鼠实验证实。ARID1A是酵母交换型转换/蔗糖非发酵的（SWI/SNF）ATP-依赖的染色质重塑复合体的核心亚基之一，其功能失调可造成染色质重塑异常进而引起肿瘤等疾病的发生。此前对人和小鼠模型的研究中还揭示了OCCC与增加的促炎性细胞因子基因表达有关。尽管在这个肿瘤中发现了诱导的促炎性细胞因子，这两种突变协同地激活细胞因子基因的机制仍旧是不清楚的。

这里，作者构建了OCCC的体外模型，利用端粒反转录酶（hTERE）-永生化的正常人卵巢上皮细胞系通过引入ARID1A基因敲减和PIK3CA突变，引起细胞转化和细胞因子基因诱导。证明了ARID1A的减少削弱了Sin3A-HDAC复合体的招募，而PIK3CA突变从IκB释放了RelA蛋白，导致了细胞因子基因的激活。文章中展示了一种NF-κB抑制剂在细胞培养和小鼠模型实验中部分减弱了OCCC的增殖，并提高了卡铂的疗效。该研究揭示了OCCC中ARID1A/PIK3CA双突变和细胞因子基因诱导的机制，并指出NF-κB抑制剂可能是一种潜在的治疗选择。因此，优先理解这个过程的分子机制可能有助于开发出克服细胞因子异常调控的策略，从而为OCCC提供一种潜在的治疗方案。

ARID1A敲减和PIK3CA激活转化正常人卵巢上皮细胞系

作者使用shRNA敲减和/或PIK3CA突变引入正常人卵巢上皮细胞系T80产生单突变（ARID1A或PIK3CA）和双突变（AE或AM）转化细胞系，双突变的细胞中细胞形态变小并失去接触抑制而堆垛生长（图1B和C），软琼脂克隆实验表明双突变的细胞系有较强的克隆形成能力（见图1D和E）。同时，在T29的细胞系中也得到了同样的结果。以上结果表明，ARID1A敲减协同PIK3CA突变足以转化正常人卵巢上皮细胞系。

图1T80细胞系中ARID1A与PIK3CA的单突变和双突变引起细胞的形态和增殖变化

说明：PIK3CAEK是天然发生的突变，有增强的酶活性；Myr-PIK3CA是改造突变并有可持续的酶活性；

AE代表ARID1AshRNA和EK；AM代表ARID1AshRNA和Myr-PIK3CA

ARID1A敲减和PIK3CA激活诱导促炎性细胞因子的表达

作者采用RNA测序法对T80和T29细胞系和转化细胞系进行转录组分析，结果显示在AM细胞系中有59个独特的基因上调。再用基因库富集分析法识别这59个基因，以检查这些上调的基因与人类OCCC的相关性。通过分析可用的OCCC病人基因表达数据库GSE，确定了在OCCC病人样本中这59个基因确实富集在上调的基因簇中，该数据支持了这些上调的基因与人类OCCC的相关性。在这识别的59个基因中，属于促炎性细胞因子的有14个基因，包括IL-1A，IL-1B，IL-6，IL-8，CXCL1和CXCL3等等（见表1）。为确定RNA的测序结果，作者利用qRT-PCR进一步检测，结果显示ARID1A敲减或PIK3CA激活的单突变细胞株基因表达只是轻微上调，而AM的基因表达显著增强（图2C）。此外，在T80细胞株中，用中和抗体结合IL-6能够减慢双突变细胞株的增殖（图2D）。

图2AM细胞系中的细胞因子基因表达异常上调

RelANF-κB转录因子是促炎性细胞因子激活的主要因子

进一步研究AM细胞株，发现细胞因子基因表达的诱导由NF-κB通路调控。NF-κB家族的转录因子包括RelA和RelB蛋白，通过siRNA敲减RelA或RelB蛋白，发现RelA蛋白能够驱使促炎性细胞因子的表达（图3B和C）。RelA和RelB蛋白由IKK信号小体差异化调节，该信号小体由IKK1（IKKα），IKK2（IKKβ）和IKKγ三个核心蛋白组成，IKK1和IKK2起激酶作用，而IKKγ作为一个调控亚基。IKK2可以磷酸化IκB，促使其降解，然后使IκB介导的胞质结合的RelA游离出来。染色体免疫共沉淀（ChIP）qPCR分析表明NF-κB结合有IL-1B，IL-6，IL-8，CXCL1基因元件的RelA占比在AM细胞株中显著增加（图3D）。

表1与图2相关的AM细胞基因表达上调

表中显示了每个基因的倍数变化；红色表示分泌的细胞因子或生长因子

图3RelA蛋白在AM细胞株中激活了细胞因子基因

通过PIK3CA-AKT-IKK2通路，PIK3CA从IκB释放RelA蛋白

先前在Jurkat细胞或人成纤维细胞的研究已经表明AKT是PIK3CA主要的下游靶基因，能调节由IκB调控的IKK2通路释放RelA蛋白。在本研究中，作者再次证实了它们的相关性。当Myr-PIK3CA细胞株表达减少了IκB，并增加了IκB的磷酸化水平，而ARID1A敲减细胞株对IκB状态没有影响（图4A）。Westernblotting也鉴定了Myr-PIK3CA细胞株中RelA蛋白在核中表达增加，而RelB蛋白不增加（图4B）。为了检测AKT是否是细胞因子诱导的下游效应子，作者使用一种AKT专一的抑制剂——MK-处理T80-AM细胞株。结果表示MK-的处理不仅恢复了IκB的水平，而且抑制了细胞因子的诱导，表明AKT是细胞因子诱导通路中不可或缺的组成部分（图4C和D）。

图4激活的PIK3CA通过AKT-IKK2通路释放RelA蛋白

ARID1A招募Sin3A-HDAC阻遏物复合体抑制细胞因子基因表达

尽管SWI/SNF复合体最可能关系到基因的激活，但是它也能够通过招募HDAC复合物抑制转录。作者首先使用ChIP分析方法阐明了ARID1A蛋白确实结合在IL-6和IL-8基因的启动子上（图5A和B）。该方法使用了pan-H4乙酰化抗体，结果显示了敲减的ARID1A细胞株引起了IL-6和IL-8基因的启动子上HDAC的增加（图5C）。由于ARID1A蛋白敲减后引起HDAC1结合的这些位点丢失，支持了招募的HDAC1结合至这些基因启动子的证据（图5D）。为检测HDAC是否抑制这些基因的表达，作者用一种HDAC抑制剂——曲古抑菌素A（TSA）处理细胞，结果极大诱导了Myr-PIK3CA细胞株的细胞因子基因表达，而对照细胞只有适量的诱导表达。表明了HDAC抑制剂和激活的PIK3CA在细胞因子诱导时的协同作用（图5E）。作者进一步阐明了HDAC1涉及到Sin3A复合体的一部分，当用siRNA敲减Sin3A后，与HDAC抑制剂相同，能够协同PIK3CA诱导细胞因子的表达（图5F）。

图5ARID1A招募Sin3A-HDAC复合体抑制细胞因子基因表达

在T80细胞系模型中已经确定的细胞因子基因激活机制，在OCCC病人来源的细胞系中也进行了实验（TOV-21G是双突变细胞，ES-2是无突变细胞），与T80细胞系中获得的结果相同，与ES-2相比，TOV-21G减少了IκB表达并增加了磷酸化IκB的表达。与此同时，RelA蛋白在TOV-21G细胞核中表达也高于ES-2细胞（图6A和B）。在TOV-21G细胞中进行与T80细胞系中相同的实验，结果均一致（图6E,F,G和H）。这些结果表明细胞因子诱导机制在OCCCTOV-21G细胞系中是保守存在的。

图6人OCCC细胞系中细胞因子基因激活机制

NF-κB抑制剂减弱了AM细胞系的增殖并提高了卡铂的疗效

作者首先使用一种NF-kB抑制剂——IKK-IIV在细胞增殖上的效果，发现对照细胞或单突变细胞没有影响，而AM细胞的生长部分减弱了。再用卡铂处理时，只有T80-AM细胞持续生长，而其他细胞都有效的阻止了（图7A）。当卡铂与IKK-IIV联用时，AM细胞也阻止了。值得注意的是，重组IL-6和IL-8能够解救这个作用，表明IL-6和IL-8的激活是抗药性作用的主要原因。与双突变T80细胞的作用效果一致，IKK-IIV部分减弱了TOV-21G细胞的增殖，当与卡铂联用时，IKK-IIV完全阻止了TOV-21G细胞的增殖（图7B）。体内实验同时表明，单独给药组显示了肿瘤生长的部分减弱，而联合给药组完全阻止了肿瘤的生长（图7C和D）。这些结果表明NF-kB抑制剂——IKK-IIV能选择性抑制双突变细胞的增殖并能提高卡铂在OCCC中的疗效。

图7NF-κB抑制剂抑制了AM细胞系的增殖并协同增强卡铂的疗效

参考文献

KimM,LuF,ZhangY.LossofHDAC-MediatedRepressionandGainofNF-κBActivationUnderlieCytokineInductioninARID1A-andPIK3CA-Mutation-DrivenOvarianCancer.,CellReports17,–.

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