卵巢癌组织及细胞株中肿瘤特异性抗原MAG

作者：周晓亮，张师前

来源：张师前(Gynecol-Oncol)

肿瘤睾丸抗原(cancer/testisantigens，CTA)是一类限制性表达于睾丸和恶性肿瘤的蛋白,被认为与细胞癌变的特性有关，因此是免疫学手段治疗癌症的理想靶位,在近年得到广泛的。其中MAGE、GAGE、BAGE家族不仅仅存在于黑色素瘤细胞中，在许多肿瘤组织也可呈现不同程度的表达，且其表达和肿瘤的发生、发展及预后关系十分密切。该类基因表达产生的抗原可以被自身免疫细胞识别，诱导机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫，MAGE、GAGE、BAGE及其产物可用于肿瘤的分子学诊断和免疫治疗。近年来卵巢癌的诊治方面取得了一些进展，但其远期生存率，尤其是晚期患者的生存率仍无显著改善。寻找肿瘤特异性抗原(tumor-specificantigen，TSA)和肿瘤相关性抗(tumor-associatedantigen,TAA)对于卵巢癌的早期发现、早期诊断和早期治疗极为重要。国内外许多学者对肿瘤MAGE、BAGE、GAGE基因的表达、功能及其机制作了大量的研究，但在卵巢癌方面的研究较少。本研究采用RT—PCR技术分析卵巢癌组织及细胞株中MAGE-1、MAGE-3、GAGE-1/2及BAGE基因mRNA水平的表达，并评价这些基因产物作为卵巢癌标志物以及卵巢癌免疫治疗靶位的可行性。

材料和方法一、细胞培养

卵巢癌细胞株SKOV3、A、COC1均是在中国建立的细胞株。SKOV3和COC1、正常卵巢上皮细胞(normalovarianepithelialcells，NOEC)医院生物工程中心提供。作为阳性对照的黑色素瘤MEL细胞系由Dr.Takesako惠赠。细胞培养液含10%胎牛血清、U/ml青霉素和U/ml链霉素的RPMI；在37℃、5%CO2和一定湿度的条件下孵育培养，当细胞生长到约80%时，常规消化收集细胞，置于-80℃冰箱保存。

二、临床资料及组织标本

正常卵巢组织14例，卵巢良性肿瘤标本20例，卵巢癌标本47例以及卵巢外癌转移灶组织7例。所取组织于手术切除后10min内液氮保存。并经病理组织学检查证实。详细记载病人的临床资料。肿瘤的组织学分级及临床分期，根据术后病理结果判定。卵巢癌临床分期按FIGO(年)分期标准。47例卵巢癌中浆液性囊腺癌18例，粘液性囊腺癌13例，子宫内膜样癌6例，透明细胞瘤4例，卵巢转移性瘤6例。Ⅰ期4例、Ⅱ期9例、Ⅲ期30例、Ⅳ期4例。组织学分级G16例，G例，G例。有腹水患者24例，无腹水患者23例。淋巴结转移21例，无淋巴结转移26例。患者年龄为23～67岁，平均年龄45.7岁。

三、MAGE-1、MAGE-3、GAGE-1/2及BAGE基因mRNA表达水平测定

Trizol(上海生物工程有限公司产品)抽提各个细胞株和组织标本总RNA。紫外分光度计测得RNAA和A，取4μgRNA用逆转录酶M-MLV和oligo-dT引物(上海生物工程有限公司产品)合成第一链cDAN。PCR引物设计在不同的外显子上，以保证扩增的特异性，避免基因组DNA污染的影响。

PCR扩增程序：MAGE-1、β-actin：94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min,共35个循环;MAGE-3：94℃变性1min，66℃退火1min15s，72℃延伸1min,共40个循环;GAGE-1,2：94℃变性1min，56℃退火2min，72℃延伸3min,共30个循环;BAGE：94℃变性1min，60℃退火2min，72℃延伸2min,共30个循环;所有PCR扩增均需预变性5min，反应末于72℃延伸6min。扩增结束后进行1.5%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳，溴乙啶染色后，紫外灯观察结果。捷达专业凝胶图像采集与分析系统(3.3版)采集分析图片。以黑色素瘤MEL细胞系为阳性对照，以不加M-MLV逆转录酶为阴性对照，以β-actin为体系内控制。根据各肿瘤特异性抗原基因在GenBank中的序列，MAGE-1、MAGE-3、GAGE-1/2及BAGE基因理想的PCR扩增长度分别为、、、bp。

四、统计学方法

所有数据资料应用SPSS10.0统计软件进行处理。计量资料采用t检验，绝经、肿瘤组织学分型、临床分期等临床病理特征之间基因表达差异的比较采用χ2检验。P0.05为有显著差异。

结果一、卵巢癌细胞株中MAGE、GAGE、BAGE基因的表达

MAGE、GAGE、BAGE在卵巢癌细胞株SKOV3、A、COC1中的表达谱不尽相同，但至少有一种基因表达。卵巢癌细胞株SKOV3表达的肿瘤特异性抗原基因有MAGE-1，2号显带为MAGE-1基因引物扩增的结果，DNA条带介于～bp之间。卵巢癌细胞株A表达的肿瘤特异性抗原基因有MAGE-1、MAGE-3及GAGE-1/2,2号为MAGE-1基因引物所扩增的结果，DNA条带介于～bp之间，3号为MAGE-3基因引物所扩增的结果，DNA条带介于～bp之间，5号为GAGE-1/2基因引物所扩增的结果，DNA条带介于～bp之间。卵巢癌细胞株COC1表达的肿瘤特异性抗原基因有MAGE-1、MAGE-3，2号为MAGE-1基因引物所扩增的结果，DNA条带介于～bp之间，3号为MAGE-3基因引物所扩增的结果，DNA条带介于～bp之间。

二、MAGE、GAGE、BAGE基因在不同卵巢组织中的表达

正常卵巢组织中MAGE、GAGE、BAGE基因无表达，良性肿瘤中仅有基因MAGE-1表达，阳性率为15%(3/20)。卵巢癌组织中及BAGE基因理想的PCR扩增长度分别为、、、bp。

MAGE-1、MAGE-3的表达率较高，分别为51.1%(25/47)、34%(16/47)。而GAGE-1/2及BAGE基因在卵巢癌组织标本中的表达率相对较低，分别为25.5%(12/47)、14.9%(7/47)。卵巢外癌转移灶标本中仅有MAGE-1、BAGE基因表达，阳性表达率分别为28.6%(2/7)、14.3%(1/7)。

三、卵巢癌病理类型与MAGE、GAGE、BAGE基因阳性表达程度的关系

浆液性囊腺癌标本中MAGE-1、MAGE-3的阳性表达率分别为77.8%(14/18)、66.7%(12/18)，明显高于其它类型卵巢恶性肿瘤中的表达率，差异有显著性(P0.05)。尽管GAGE-1/2及BAGE基因在卵巢癌组织中的表达率相对较低，但在浆液性囊腺癌中仍有相对较高的阳性表达率。

四、MAGE、GAGE、BAGE基因表达与卵巢癌临床病理特征的关系

对表达与不表达MAGE、GAGE、BAGE基因的卵巢癌患者进行临床资料分析，MAGE、GAGE、BAGE基因与是否绝经及有无淋巴结转移无显著差异(P均0.05);MAGE-1、MAGE-3的阳性表达与卵巢癌患者的病理分级及临床分期呈正相关，差异有显著性(P0.05)，而BAGE、GAGE-1/2的表达则与病理分级及临床分期无关(P0.05);有无腹水则仅与BAGE基因的表达相关，伴有腹水的卵巢癌患者BAGE表达的阳性率较高，两者差异有显著性(P0.05)，见表4。

讨论

目前MAGE基因已发现有23个家族成员，均位于人X染色体上，在多种肿瘤中有较高程度的表达。其编码产生蛋白质的氨基酸超过个，分解产生的肽段可与各种类型的人白细胞抗原结合，形成能被自体T淋巴细胞识别的复合物。GAGE基因家族至少有8个近源基因，均定位于人X染色体上，其中GAGE-1、GAGE-2基因表达产生抗原肽段YRPRPRRY与HLA-Cw*结合的复合物可以被激活的细胞毒性T淋巴细胞识别。除早期发现的BAGE基因家族外，目前又发现了5个新的BAGE基因，它们均定位于13和21号染色体的着丝粒旁，此外有9个BAGE基因节段位于第9、13、18和21号染色体着丝粒旁区域。上述基因和基因节段具有高度同源性(90%-99%)。BAGE基因编码产生含43个氨基酸的多肽，其中AARAVFLAL片段与HLA-Cw*分子结合，被激活的细胞毒性T淋巴细胞识别。

MAGE、BAGE、GAGE蛋白在肿瘤细胞内经低分子量多肽(lowmolecularweightpolypeptide，LMP)加工而形成肽段，再由抗原加工相关转运物(transporterassociatedwithantigenprocessing，TAP)转运而进入内质网腔，抗原肽与MHCⅠ分子结合，经高尔基体表达于肿瘤细胞表面。CTL通过T细胞抗原受体(TCR)识别抗原肽和MHCⅠ类分子复合体，通过杀伤机制使肿瘤细胞死亡。因此MAGE、BAGE、GAGE基因及其产物为肿瘤特异性、主动性免疫疗法开辟广阔的应用前景。

基因性肿瘤标记物研究表明，多数不同类型卵巢癌表达BAGE、MAGE-1/-3、GAGE-1/2，而正常卵巢组织和体液表达阴性。Russo等用RT-PCR方法测试54例上皮性卵巢癌MAGE-1和MAGE-3的转录水平，结果表达率分别为28%和17%，BAGE和GAGE的阳性表达率为15%和31%，且MAGE-1的表达随肿瘤临床分期增加而升高(MAGE-1在Ⅲ期和Ⅳ期卵巢癌的表达率分别为22%和43%)。Gillespie等研究发现，MAGE-1在卵巢癌中的表达率为56%，而MAGE-2、-3、-4，BAGE，GAGE阳性表达率相对较低。Hofmann等检测经细针穿刺获得的腹水标本，56%(15/27)的BAGEmRNA为阳性，MAGE-1mRNA为7%(2/27)，MAGE-3mRNA为30(8/27)，GAGE-1/2为30%(8/27)，其联合检测敏感性94%，特异性亦94%，1例呈假阳性。因此认为，检测卵巢癌腹水BAGE、GAGE和MAGE的mRNA不失为一有潜力的诊断方法。

本研究中正常卵巢组织中MAGE、GAGE、BAGE基因无表达，良性肿瘤中仅有MAGE-1基因表达，阳性率为15%(3/20)。卵巢癌组织标本中MAGE-1、MAGE-3的表达率较高，分别为51.1%(25/47)、34%(16/47)，MAGE-1表达率略低于Gillespie等的研究结果。而GAGE-1/2及BAGE基因在卵巢癌中的表达率分别为25.5%(12/47)、14.9%(7/47)，明显高于Gillespie等的研究结果。卵巢外癌转移灶中仅有MAGE-1、BAGE基因表达，阳性表达率分别为28.6%(2/7)、14.3%(1/7)。浆液性囊腺癌中的MAGE-1、MAGE-3基因阳性表达率明显高于其它类型卵巢恶性肿瘤(P0.05)。

进一步对MAGE、GAGE、BAGE基因的表达情况与47例资料完整的卵巢癌临床资料进行了统计分析，结果发现基因的表达与是否绝经及有无淋巴结转移无关，而MAGE-1、MAGE-3基因的阳性表达与细胞分化程度及肿瘤临床分期密切相关(P0.05)，组织分化程度越低，临床分期越晚，其表达率越高。因此我们认为，MAGE-1、MAGE-3基因与卵巢癌恶性程度及预后密切相关，可作为一个独立的肿瘤预后监测指标。伴有腹水的卵巢癌患者BAGE表达的阳性率较高(P0.05)，这与Hofmann等的研究结论(56%的BAGEmRNA为阳性)相一致，提示BAGE可能与腹水的形成及发展有关。此外，本研究中MAGE、GAGE、BAGE基因在卵巢癌细胞株SKOV3、A、COC1中的表达，进一步验证了这些基因在肿瘤诊断中的作用。有研究表明用MAGE基因产物制造的疫苗具有可接受的毒性，在不配伍其他治疗措施的情况下肿瘤也有较好反应。MAGE-3基因已经在基因芯片中作为一个可靠标志来检测外周血中黑色素瘤细胞的存在，也可能用来监视肿瘤细胞浸润生长的状态，以便提供合适的治疗干预措施。

MAGE、BAGE、GAGE家族基因表达产物为肿瘤特异性抗原，不同组织类型的肿瘤中均有较高的阳性表达率，因此在肿瘤免疫治疗的研究中倍受。目前关于MAGE、BAGE、GAGE在卵巢癌疫苗应用研究中较为普遍的是肽疫苗和DC疫苗。尽管近年来国内外许多学者对该族基因尤其是MAGE进行了大量的研究，也取得了不少成果，但认识仍不够充分。由于肿瘤细胞的异质性，不同类型的卵巢肿瘤或同一肿瘤的不同部位MAGE、BAGE、GAGE家族成员的表达存在差异，如何选择免疫治疗的靶抗原存在很大的困难。通过本研究，我们认为MAGE、BAGE、GAGE作为卵巢癌分子标志以及肿瘤免疫治疗特异性靶位，尚需要更深入的探讨。

赞赏

长按向我转账

受苹果公司新规定影响，iOS版的赞赏功能被关闭，可通过转账支持。

北京治疗白癜风哪间医院权威
白癜风有什么偏方可治嘛