促使血管正常化联合溶瘤病毒增强晚期卵巢癌

在所有影响女性生殖道的恶性肿瘤中，卵巢癌是最主要的死因，长期以来，人们一直在考虑是否可以对肿瘤细胞产生免疫反应来消灭癌症。最近，一种改良的疱疹病毒(T-VEC，Amgen)被批准作为治疗黑色素瘤的药物，这增加了人们对溶瘤病毒治疗领域和这些药物潜在的免疫刺激作用的兴趣。溶瘤病毒(OV)优先感染和杀死肿瘤细胞，而不影响正常的体细胞。在这一过程中，这些制剂还刺激先天免疫细胞运输，以响应病毒和细胞死亡相关蛋白，从而加强适应性免疫细胞对TAA的交叉激发。新城疫病毒(NDV)在动物模型中具有长期的溶瘤作用。NDV的临床试验测试历史最长，已经证明对多种癌症有效，包括晚期结直肠癌(15例)、乳腺癌(16例)、卵巢癌(17例)和转移性肾细胞癌(18例)，每种癌症都有部分或完全反应。NDV已被证明可以克服免疫抑制的肿瘤微环境，并通过增加细胞因子的产生，特别是干扰素(IFN)的产生，直接导致免疫反应的诱导。新城疫病毒融合蛋白的切割能力是其毒力的主要决定因素，为修饰该蛋白以提高治疗效果提供了可能性。

常规的溶瘤病毒抗肿瘤机制中，有一种溶瘤病毒是通过刺激肿瘤细胞内皮细胞，形成微血栓，从而阻断肿瘤细胞的供养，达到抗肿瘤疗效，而在本文中，与这种相反，采用了一种修复血管的“血管正常化”策略促使药物有效地送至肿瘤内部。

为了满足氧气和营养的需求，肿瘤通过分泌血管内皮细胞生长因子(VEGF)等因子来响应缺氧、癌基因和肿瘤抑制基因的丢失，从而启动了一种粗略的血管生成过程。由此产生的血管普遍结构异常，比如具有不规则的分支，基底膜丧失完整性，血管周围细胞不足或缺失，异源血流累积和血管通透性增加等。这些血管的低效阻碍了癌症治疗(如化疗)向肿瘤核心的输送。这种有限的血管灌注也选择了肿瘤微环境中的缺氧和酸性，这已被证明限制了药物的有效性并加剧转移。目前的“血管正常化”治疗策略是抑制促血管生成因子或上调抗血管生成因子的分子来恢复这些信号的适当平衡，修复肿瘤血管。阻断血管内皮生长因子是实现血管正常化的最常见方法，而抗血管内皮生长因子药物，主要是与化疗相结合，在抗癌方面取得了临床上的成功。

凝血酶敏感蛋白-1是一种天然的血管生成抑制因子，存在于各种类型的细胞表面和细胞外基质中。该蛋白含有三个同源的凝血酶反应蛋白1型重复结构域(3TSR)，通过与内皮细胞上的CD36受体结合，抑制内皮细胞的增殖和迁移，使其具有大部分抗血管生成特性。作为一种抗卵巢癌药物，3TSR还具有通过转化生长因子β激活直接抑制肿瘤细胞增殖和迁移的额外好处。作为一种具有生物活性的小分子重组多肽，3TSR已被证明在多种模型中具有显著的抗肿瘤作用，无论是单独或联合化疗。3TSR能有效地诱导晚期卵巢癌小鼠模型的血管正常化，并增强肿瘤对腹腔注射化疗药物的摄取。我们推测，NDV给药前进行3TSR预处理，可以减轻溶瘤病毒治疗中常见的血管关闭，并增加肿瘤中的病毒和免疫细胞的数量，从而导致晚期EOC的消退。

要点一：联合血管正常化和溶瘤病毒治疗可使晚期卵巢癌发生显著消退

小鼠卵巢囊下注射1xID8细胞，肿瘤在没有干预的情况下发展，直到60dPTI。在这一阶段，小鼠表现出与III期卵巢癌妇女相似的疾病，要么注射4mg/kg的3TSR，要么腹腔注射3TSR4mg/kg。15天，一次性静脉注射。在第74天注射1.0xPFU新城疫病毒(F3aa)，或两者兼而有之。第90天处死PTI小鼠，收集原发肿瘤称重。与PBS治疗的对照组相比，所有治疗方法均显著降低了终点的原发肿瘤重量。3TSR+NDV(F3aa)联合治疗的原发肿瘤重量减轻幅度最大。所有单独使用新城疫病毒(F3aa)治疗的动物都显示出与血管关闭一致的发白的肿瘤(箭头)。

B，与对照组相比，所有治疗组在终点的继发性病变数量均显著减少。在3TSR+NDV(F3aa)联合治疗组中，50%的动物在终点完全没有继发性肿瘤。转移性病变用箭头表示。显示了平均值+/-SEM。这些数据代表了三个单独的动物实验的结果(每个实验组N=12-15)。

要点二：3TSR预处理诱导血管正常化并减少卵巢肿瘤缺氧

在PTI的第90天收集原发的小鼠卵巢肿瘤。

A.免疫荧光标记CD31、α-SMA、F3aa和3TSR+F3aa组卵巢肿瘤冰冻切片上的血管周细胞(F3aa、F3aa和CD31aa)的免疫荧光染色结果，并与正常对照组进行比较，结果显示CD31R和CD31SMA免疫荧光共定位的阳性细胞数分别为3TSR组、3TSR组和3TSR+NDV组(F3aa和F3aa组)。共定位显示，用3TSR预处理的动物肿瘤中成熟的周细胞覆盖的血管比例增加，而单独用新城疫病毒(F3aa)治疗的动物肿瘤中血管结构的表型丢失和灶性坏死。

B.新城疫病毒(F3aa)感染前经3TSR预处理后，原发肿瘤组织中缺氧诱导的加合物形成明显，与单独使用新城疫病毒(F3aa)相比，差异有统计学意义。

结果：与单独使用PBS或NDV（F3aa）相比，用3TSR治疗的所有小鼠原发性肿瘤的血管灌注增强，显着降低了缺氧

C.血管内皮细胞(CD31，红色)、血管周细胞(α-SMA，绿色)和缺氧(低氧探针，蓝色)的免疫荧光定位显示，异常血管周围的EOC肿瘤较正常血管周围的缺氧程度更高。结果：与低氧组织相比，低氧视野范围内的血管中CD31和α-SMA阳性血管比例明显更高

D、血管内皮细胞(CD31，红色)、周细胞(αSMA，绿色)和缺氧(HPI，Cyan)的三定位也显示正常血管的氧梯度距离较无周细胞覆盖的血管显著增加。图像是以倍和倍的放大倍数采集的。显示了平均值+/-SEM。数据代表每个实验组N=4个肿瘤和每个切片3到4个感兴趣区域的结果。结果：正常化血管与缺氧区域之间的平均距离为.76μm，而非正常化（aSMA阴性血管）的平均距离为19.10μm

要点三：新城疫病毒(F3aa)对小鼠和人卵巢癌细胞有直接溶瘤作用，但对正常卵巢表面上皮细胞无直接溶瘤作用

A为正常卵巢表面上皮细胞(NSE)，B为自发转化的小鼠卵巢上皮性癌细胞(ID8)，C为人卵巢上皮性癌细胞(CAOV-3)，接种于不同稀释度的新城疫病毒(F3aa)中48h。加入Reazurin潜伏期为4小时。通过对模拟感染对照组的正常化来确定活细胞的百分比。增加新城疫病毒(F3aa)的多重感染导致小鼠和人卵巢癌细胞代谢活性降低，但正常卵巢表面上皮细胞在MOIS试验中未受影响(N=3)。

要点四：小鼠ID8细胞的病毒复制能力有限，但对干扰素保持敏感

A，新城疫病毒(F3aa)-GFP感染的ID8细胞(MOI为0.5)在不同时间点的免疫荧光检测。GFP转基因在这些细胞中的表达有限，与低复制相一致。结果：GFP阳性细胞数量有限证明了在所有时间点ID8细胞中的表达均受到限制

B，在相同条件下用新城疫病毒(F3aa)-GFP感染CAOV-3细胞，进行直接比较，发现GFP基因在CAOV-3细胞中有较高水平的表达。结果：相反，用NDV（F3aa）-GFP感染CAOV-3细胞，可在p.i早8小时产生更高的GFP表达。

C，建立新城疫病毒(F3aa)在MOI为0.5的ID8细胞中的一步病毒生长曲线，并在指示的时间点P.I.后收集上清液并用TCID50滴定。结果：三种细胞系之间病毒复制的动力学没有差异

D，用I型干扰素受体阻断抗体预处理1小时，然后加入干扰素-β(0-pg/mL)作用2小时，然后在MOI为10的条件下感染新城疫病毒(F3aa)-绿色荧光蛋白。结果：72小时后对细胞活力的评估显示，ID8细胞对IFN-b有反应，并且浓度升高保护了ID8细胞免受NDV（F3aa）-GFP的细胞溶解作用。

E，新城疫病毒(F3aa)-绿色荧光蛋白感染细胞的典型图像：仅(左)用干扰素-β预处理或(右)用干扰素受体阻滞剂+重组干扰素处理的新城疫病毒(F3aa)-绿色荧光蛋白感染细胞。24小时和48小时腹腔注射，另设模拟感染对照组。数据代表三个独立实验(N=3)的结果。结果：为了确定用rIFNβ进行的预处理是否也阻断了病毒蛋白的表达，而不仅仅是NDV（F3aa）-GFP的细胞毒性作用，我们在p.i48h评估了GFP转基因的表达。在有和没有IFNAR阻断的rIFN-β处理的细胞中。对于rIFN-β反应性ID8细胞系，rIFN-β预处理也导致NDV介导的转基因表达停止。

F，为了评估ID8，CAOV-3和NOSE细胞产生IFN-b的能力受损的程度，用NDV（F3aa）-GFP以MOI为0.5感染细胞，并收集12、24、48和圆周率72小时并通过ELISA测量IFN-b的水平，干扰素-β(干扰素-β)在MOI为0.5时感染新城疫病毒(F3aa)后，可在ID8、CAOV-3和鼻腔细胞中诱导产生干扰素-干扰素(Interferon-DNA，IFN-DNA)。分别于12、24、48、72h收集上清液。用小鼠和人干扰素-β酶联免疫吸附试验(n=3)检测培养上清液中干扰素-β的水平。结果：在转化的CAOV-3和ID8细胞中，IFN-b的产生在p.i24小时达到峰值。分别释放pg/mL和pg/mL。

要点五：血管正常化和溶瘤病毒联合治疗增加免疫细胞转运和肿瘤摄取

在肿瘤开始后90天，从对照组小鼠和3TSR、新城疫病毒(F3aa)或两者联合治疗的小鼠身上收集原发肿瘤。石蜡包埋肿瘤切片进行免疫组织化学染色，分别检测A、巨噬细胞(CD68)、B、中性粒细胞(Ly-6C/G)、C、自然杀伤细胞(NKG2D)、D、T细胞毒细胞(CD8)、E、T辅助细胞(CD4)和F，B/浆细胞(CD)。结果：与未治疗对照组相比，3TSR治疗组肿瘤内巨噬细胞、NK细胞、细胞毒性T细胞和辅助性T细胞的浸润增加。虽然新城疫病毒(F3aa)单独治疗不能促进白细胞的转运，但与3TSR联合应用可显著增强瘤内巨噬细胞、NK细胞和细胞毒T细胞的浸润。图像是以倍的放大倍数拍摄的。

要点六：联合治疗可提高肿瘤内免疫细胞的活性，3TSR可降低免疫抑制细胞因子的表达

在肿瘤开始后90天，从对照组小鼠和3TSR、新城疫病毒(F3aa)或两者联合治疗的小鼠身上收集原发肿瘤。免疫荧光共定位通过探测肿瘤切片同时检测NK细胞(NKG2D；红色)和早期激活标志CD69(绿色)，以及细胞毒性T细胞(CD8；红色)和增殖(Ki67；绿色)。

A，NDV(F3aa)和联合治疗(3TSR+NDV(F3aa))的激活NK细胞比例高于PBS对照组或3TSR处理组。结果：在原发性肿瘤上进行的免疫荧光共定位显示，与对照组或单独使用3TSR的小鼠相比，经NDV（F3aa）治疗的小鼠肿瘤中活化的NK细胞的比例更高。3TSR+NDV（F3aa）处理的小鼠原发肿瘤中活化的NK细胞比例显着增加

B，3TSR单独或与新城疫病毒(F3aa)联合应用时，CD8+T细胞增殖活跃的比例明显高于生理盐水对照组。图像是以倍和倍的放大倍数拍摄的。x面板中的白色方框表示选择放大倍的区域。在肿瘤开始后90d，PBS对照组和3TSR组小鼠均收集到原发肿瘤。肿瘤组织进行免疫抑制细胞因子WesternBlot分析。3TSR治疗可降低VEGF、CCL22、IL-10、IL-6和TGFb的蛋白水平。结果：同样，与对照组相比，CD8+T细胞和增殖标记物Ki67的免疫荧光共定位证实了在所有治疗组中增殖性CD8+T细胞的流入增加。

C，在肿瘤开始后90天，从PBS对照和用3TSR治疗的小鼠中收集原发性肿瘤。对肿瘤组织进行免疫抑制细胞因子的蛋白质印迹分析。3TSR处理导致VEGF，CCL22，IL-10，IL-6和TGFb的蛋白质水平降低。对来自n＝3只小鼠/组的蛋白裂解物进行光密度分析，数据表示为细胞因子表达与GAPDH表达的比率。评价来自对照（PBS）小鼠或PTI处理60天的小鼠的肿瘤的免疫抑制细胞因子VEGF，CCL22，IL-6，IL-10和TGF-bl的表达。

结果：与PBS对照相比，3TSR处理导致所有免疫抑制细胞因子水平降低

结论及讨论：3TSR治疗肿瘤血管正常化，增强原发上皮性卵巢肿瘤的血流灌注，并诱导疾病消退。接受联合治疗的动物在原发肿瘤质量、腹水堆积和继发性病变方面的减少幅度最大(50%的小鼠完全没有腹膜转移)。联合使用3TSR+NDV(F3aa)可促进免疫细胞向原发肿瘤核心的转运。

首次证明，新城疫病毒和其他溶瘤病毒一样，是促血管闭合的一个强有力的介体，通过血管正常化疗法来阻止这一点可以促进晚期卵巢癌临床前模型的消退。这挑战了目前的热点机制，即诱导血管内血栓形成是成功的溶瘤病毒治疗的必要条件。

DOI：10./-.CCR-18-

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