亲和力调节的ErbB2或EGFR嵌合抗原

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摘要:

靶标介导的毒性是用于实体瘤的过继细胞治疗的嵌合抗原T细胞受体（CAR）发展的主要限制。在这项研究中，我们开发了一种策略来调整CAR的scFv组件的亲和力，以区分在目标组织中以生理水平表达目标的正常组织中过表达目标的肿瘤。产生表达CAR的T细胞板，靶抗原亲和力变化超过三个数量级。高亲和力细胞可识别靶标以任何水平表达，包括正常细胞中无法通过流式细胞仪检测到的水平。亲和力调节的细胞表现出与高亲和力细胞相似的强大抗肿瘤功效，但保留了表达生理学指标水平的正常细胞。亲和力调节的scFvs的使用提供了一种策略，可以使CART细胞更广泛地用于针对实体瘤上过度表达的经过验证的靶标，包括被该方法认为不可药物治疗的靶标。

选择高度组织受限的抗原，睾丸癌抗原，突变的基因产物或病毒蛋白作为靶标可以显着提高使用CART细胞的安全性。但是，这些抗原都不是常见癌症中的高频率存在。可以被CART靶向的大多数排名最高的靶抗原都在潜在重要的正常组织中表达，例如ErbB，EGFR，MUC，PSMA和GD（0）。当前的生成CAR的策略包括选择具有高亲和力的scFv，如先前的研究表明，激活阈值与scFv的亲和力成反比（、）。但是，发现在TCR刺激后，对于最佳的T细胞活化而言，亲和力的窗口很窄，增加TCR的亲和力并不一定会提高治疗效果（3、4）。

在这里，我们测试了这样的假设，即为T细胞配备高亲和力的scFv可能会限制CAR的使用，这是由于CART对于以较低水平表达相同抗原的肿瘤和正常组织的辨别能力很差。我们试图确定微调scFv的亲和力是否可以提高CART细胞从较低水平表达相同抗原的正常组织中区分肿瘤的能力。在这项研究中，针对多种肿瘤细胞以及来自多个组织的原代细胞系，测试了与两个经过验证的靶标ErbB和EGFR有亲和力的CAR，这些靶标在多种癌症中均被扩增或过表达，但在正常组织和器官中也可以较低水平表达。我们发现降低scFv的亲和力可以显着提高CAR的治疗指数，同时在体外和异种小鼠肿瘤模型中均保持强大的抗肿瘤功效。

实验结果：

降低抗ErbBscFv的亲和力可改善ErbBCART细胞的体外治疗指数

我们用流式细胞仪（图A）测量了一系列具有广泛ErbB表达的肿瘤细胞系。SK-OV3（卵巢癌），SK-BR3（乳腺癌），BT-（乳腺癌）过表达ErbB，而EM-Meso（间皮瘤），MCF7（乳腺癌），93T（胚胎肾93细胞），A（肺癌，64mel（黑色素瘤），PC3（前列腺癌），MDA3（乳腺癌）以较低的水平表达ErbB，而在MDA（乳腺癌）中未检测到ErbB。还通过实时PCR测量了ErbBmRNA的水平，两种技术之间存在很强的相关性（补充图S）。

图.ErbB亲和力调节的CART细胞和肿瘤细胞系的表征。A，检测ErbB在肿瘤和细胞系上的表面表达。用抗ErbBAffibody-生物素染色细胞，并用APC检测（开放直方图）。单独与APC一起孵育的细胞表示背景（灰色直方图）。B，在mRNA电穿孔的T细胞中亲和力调节的CAR表达的FACS分析。用指示的CARmRNA电穿孔T细胞，电穿孔一天后，使用抗小鼠IgGFab抗体（对于CD9.BBZ和ErbB.BBZCARs）检测CAR表达。没有电穿孔的T细胞用作阴性对照。

C，测量了肿瘤细胞刺激后CART细胞上CD37（4-BB）表达的诱导。电穿孔后一天，将各种CART细胞（KD，nmol/L）与所示的肿瘤细胞系共培养。4小时后测量CD37和CD3的表达（CD3+门控）。

D，测量培养上清液中的细胞因子分泌（ELISA）。如图所示，用亲和力调节的ErbBCARmRNA电穿孔T细胞。电穿孔后一天，将CART细胞与所示的肿瘤细胞系共培养4小时。条形图显示了IFNγ（上图）和IL（下图）的代表性实验结果（值代表一式三份的平均SD）。

E，CD07a在肿瘤刺激的CART细胞上表达上调。用编码指示的scFv的ErbBCARmRNA对T细胞进行电穿孔，一天后，将CART细胞与指示的细胞系共培养4小时。测量CD07a表达的CD3+T细胞（值代表四个相似的独立实验的平均SD）。

具有较低亲和力scFv的ErbBCAR区分表达低水平和高水平ErbB的肿瘤细胞

为了排除可能导致上述结果的任何肿瘤特异性作用，我们测定了ErbB基因组的活性。针对表达不同水平的ErbB的单个肿瘤系的BBZCART细胞。我们观察到表达更高亲和力的scFvs（4D5和4D5-7）的T细胞识别以低至0.00mg的剂量用ErbBRNA电穿孔的K56细胞，比流式细胞术检测到的0.mgmRNA低00倍（图。A和B）。相反，具有较低亲和力scFvs（4D5-5和4D5-3）的CAR仅以0.5mg（4D5-5；图A）或更高的剂量识别K56电穿孔的ErbBRNA，表明CART细胞敏感性降低了-（4D5-5）至高亲和力4D5CART细胞的,倍（4D5-3）。此外，通过进行基于CFSE的增殖测定（图C）证实了在较低亲和力的ErbBCAR（4D5-5和4D5-3；图A和B）中观察到的与抗原剂量相关的反应性。有趣的是，将CARRNA剂量降低5倍（从0mgRNA/00mLT细胞降至mgRNA/00mLT细胞），进一步提高了具有较低亲和力CARs的T细胞的抗原识别阈值（通过细胞因子分泌评估）（图B），表明在T细胞表面上CAR密度的微调也是重要的变量。

我们使用了基于荧光素酶的CTL分析来确定具有降低亲和力的CAR的T细胞是否可以维持针对过量表达ErbB靶标的有效杀伤活性，同时保留表达较低ErbB水平的细胞。当用0mgErbBRNA转染Nalm6靶细胞时，具有较高或较低亲和力的ErbBCARs的T细胞可有效裂解靶细胞。具有较高亲和力scFv（4D5和4D5-7）的CAR表现出对转染了mgErbBRNA的靶细胞的有效裂解活性，而具有较低亲和力的scFv（4D5-5和4D5-3）显示出降低的杀伤活性。最后，只有在用0.mgErbBRNA电穿孔后，具有较高亲和力scFv的CAR才能杀死表达极少量靶标的靶细胞（图D）。这些数据支持微调ErbBCART细胞的亲和力可增强对ErbB过表达肿瘤与低或不可检测ErbB表达水平的细胞的区分。

亲和力降低的ErbBCART细胞无法识别ErbB的生理水平

鉴于先前发生的高亲和力ErbBCAR的给药后发生了严重不良事件，该高亲和力的ErbBCAR掺入了亲本4D5曲妥珠单抗的scFv（8），因此，评估亲和力降低的ErbBCART细胞对生理水平的潜在反应性至关重要的ErbB表达。为了解决这个问题，测试了从不同器官分离的六个原代细胞系的ErbB表达。大多数初级细胞系具有可检测的表面ErbB水平，而神经祖细胞系表达的靶标水平最高（图3A）。表达高亲和力4D5CAR的T细胞对所有测试的原代细胞都具有强烈的反应性，如CD07a上调的水平所证实（图3B）。但是，表达亲和力降低的ErbBCARs4D5-5和4D5-3的T细胞除对神经祖细胞的反应性弱外，对原代细胞没有反应性。

图3.ErbB对原代细胞系的选择性靶向。

图A，使用抗ErBbAffibody-生物素对细胞系进行染色，并使用APC检测（开放直方图）；仅用APC染色的细胞用作对照（灰色直方图）。

图B，用所示细胞系刺激CART细胞组4小时，并通过选通CD3+细胞来测量表达CD07a的CART细胞的百分比。

亲和力降低的ErbBCART细胞可在体内消除肿瘤并大大降低了对表达生理水平ErbB的组织的毒性

为了扩展上述体外结果，在具有晚期血管化肿瘤异种移植物的NSG小鼠中进行了一系列实验。基于以上图A中的数据，选择人卵巢癌细胞系SK-OV3作为代表性的ErbB过表达肿瘤，并选择PC3（人前列腺癌系）来模拟正常组织ErbB水平。我们首先比较了表达高亲和力4D5scFv或低亲和力45D-5scFv的ErbBCART细胞在第8天建立的侧翼SK-OV3肿瘤的NSG小鼠中的抗肿瘤功效（补充图S5）。连续的生物发光成像显示，高亲和力和低亲和力的CART细胞均可导致肿瘤的快速消除。

图5.亲和力调节的ErbBCART细胞可提高治疗指数并诱导小鼠晚期血管化肿瘤消退。A，通过亲和力调节的CARs对高表达ErbB（SK-OV3）和低表达ErbB（PC3）的肿瘤进行体内鉴别。在植入双肿瘤的NSG小鼠中测试了通过慢病毒转导修饰了不同亲和力ErbBCARs的T细胞。在第0天，在小鼠的右侧腹中（n?5）植入PC3-CBG肿瘤细胞（06细胞/小鼠，皮下）。在第5天，向相同的小鼠注射SK-OV3-CBG肿瘤细胞（5左侧腹中06个细胞/小鼠，sc）。在PC3肿瘤接种后第3天，用T细胞（静脉）治疗小鼠。如图所示，以单次注射07/小鼠（万）或/小鼠（万）的方式注射CART细胞。用未转导的T细胞处理的小鼠用作对照。在PC3肿瘤接种后的指定时间对动物成像。B，用所示的ErbBCAR治疗的双肿瘤移植NSG小鼠中SK-OV3肿瘤大小（左）或PC3肿瘤大小（右）。测量肿瘤大小，并计算肿瘤体积并作图。C，针对肿瘤大小的生物统计学分析结果。分析第56天（PC3）或第5天（SKOV3）的数据（未转换）。方法是混合模型，其中天，组和天组交互为固定效果，而鼠标为随机效果。为了获得随机效果，每只鼠标具有单独的截距和斜率（该方法也称为随机系数）。呈现的P值为交互作用P值。

scFv的亲和力调节可提高EGFRCART细胞的治疗指数

为了测试微调scFv亲和力的策略的广泛适用性，我们评估了一组EGFRCAR。EGFR.BBZCARs由衍生自亲本人类抗EGFR抗体C0的scFv构建而成（）。EGFR特异性scFv面板的单价亲和力在大约倍的范围内变化（7）。将4，P-4，P3-5和C0scFvs克隆到基于RNA的载体中，并在体外转录以进行T细胞mRNA电穿孔。分析了CAR表面表达的水平，发现在EGFRCAR构建体之间相似（图6A，顶部）。为了比较EGFRCARs组的反应性，用在细胞表面具有广泛EGFR表达范围的EGFR表达肿瘤细胞系刺激了CART细胞（图6A，底部）。通过CD07a上调的水平评估CART细胞的活化。数据总结在图6B中。较高亲和力的EGFRCAR（4.BBZ和P-4.BBZ）对所有EGFR阳性肿瘤系（MDA，MDA3和SK-OV3）均反应，而与EGFR表达水平无关（图6B）。然而，较低亲和力的EGFRCARs（P3-5.BBZ和C0.BBZ）对表达EGFR的肿瘤细胞系的反应性与EGFR表达水平相关。此外，较低亲和力的EGFRCARs与较高亲和力的EGFRCARs相比，对EGFR过表达的肿瘤MDA表现出更强的反应性，同时引发了对EGFR低表达细胞的弱得多的反应（图6B）。EGFRCART细胞均未与EGFR阴性肿瘤系K56反应。

图6.EGFR亲和力调节的CART细胞和肿瘤细胞系的表征。A，用抗人IgGFab染色用EGFRCARmRNA电穿孔的T细胞上的CAR表达，并通过流式细胞术染色进行检测（上图）；显示了scFv的亲和力（nmol/L）。肿瘤线（底部）用抗EGFR染色Affibody-FITC（开放直方图）；相同的细胞用小鼠IgG-FITC染色作为同种型对照（灰色直方图）。

讨论区：

CART细胞的功效部分取决于靶抗原在肿瘤组织与正常组织中的差异表达。我们的结果表明，可以通过亲和力调整来重新设计具有已知严重的靶上毒性的CAR，从而在消除或减少毒性的同时保持强大的体内功效。尤其是，由于认识到心肺组织中表达的ErbB的生理水平，基于曲妥珠单抗的4D5CAR具有致命毒性（8）（）。在这里，我们证明了通过将CART细胞中使用的scFv的亲和力降低到3个对数，可以看到ErbB和EGFRCART细胞的治疗指数有了实质性的提高。与高亲和力的CAR相比，具有较低亲和力的scFv的CART细胞对过表达ErbB的肿瘤表现出同样强大的抗肿瘤活性，但对生理学水平的ErbB的反应性却大大降低。

B细胞谱系抗原CD9和CD0特异的CARs已由多个小组测试，并已显示出对B细胞恶性肿瘤的有效功效（3）。但是，在实体瘤中，除了肿瘤特异性同种型（例如EGFRviii）（4）外，预期对靶标的毒性是对CART细胞的严重限制。与使用完整抗体或抗体药物偶联物的抗体疗法相比，CAR的这种局限性预期更为严重，因为与基于抗体的疗法相比，CART细胞的靶敏感性的下限要低几个数量级。我们目前使用ErbB或EGFRmRNA电穿孔的靶细胞的研究与以前的研究一致，表明CART细胞可以识别每个细胞具有约00个靶的肿瘤细胞（5）。相反，ErbB的扩增发生在大约0％至5％的原发性人类乳腺癌中，并且通常导致ErbB蛋白的过表达，每个细胞的拷贝数百万（6、7）。目前，可用数据表明，癌细胞对ErbB定向治疗无效时，不会失去ErbB表达（8）。

我们的发现支持了Chmielewski（）的先前工作，表明高亲和力的CAR在具有高或低靶标表达水平的靶细胞之间显示出较少的区分。但是，目前的结果也有不同于Chmielewski及其同事的研究结果。因为报告中没有任何较高亲和力的CAR（KD范围为5至6nmol/L）对ErbB低水平表达的细胞有反应，而较低亲和力的CAR仅识别带有扩增的ErbB的肿瘤没有明显的减少与亲和力更高的CAR相比，T细胞的功效更高。相比之下，我们发现使用4D5scFv且KD为0.3nmol/L的ErbBCAR对角质形成细胞甚至对转染了极低量ErbBmRNA的细胞系具有强烈反应性，其可检测水平低于可检测水平00倍，而亲和力调节的CART在体外和侵袭性小鼠肿瘤模型中，细胞保留了对ErbB扩增的肿瘤的反应性，其效力至少与高亲和力CAR一样。可以解释这些差异的一些变量包括使用可能识别不同表位的不同scFv（C5.6与4D5），不同的CAR信号域结构（单独的Zeta与4-BB-zeta）以及不同的基因转移方法（逆转录病毒转导与RNA电穿孔或慢病毒转导）可能会影响T细胞上CAR表面的表达水平。总之，这表明在相关临床情况下选择CAR的亲和力时应考虑所有这些因素。

更有效的过继转移策略的出现促使使用较弱的免疫治疗策略重新评估以前认为安全的靶标（9）。使CART细胞的治疗指标最大化的策略包括靶标选择，CAR设计，细胞制造和基因转移技术。除了亲和力调节外，正在开发用于控制靶毒性的其他策略，包括使用双重CART细胞方法（30，3），条件缺失和自杀系统（3，33），以及重复输注具有mRNACARs的T细胞具有瞬时表达和自限毒性（34）。

pMHC在APC表面上有效激活T细胞需要TCR-pMHC相互作用的最佳停留时间，该时间足够长以完成信号级联，但又足够短以允许pMHC串联多个TCR分子，特别是当pMHC密度高时低（35，36）。将TCR亲和力提高到“天然”亲和力范围（-00mmol/L）以上可能会降低识别低密度pMHC的能力（37-39）。高亲和力TCR对低密度同源pMHC的反应性可以通过降低MHC表达（39），或通过使用突变的MHC分子（35）或用板结合的pMHC分子刺激（38）来降低TCR-pMHC相互作用来挽救。这些发现表明，具有非常高亲和力的TCR的T细胞的激活不仅取决于密度pMHC在APC上的表达，但TCR与MHC的相互作用以及内源性pMHC的存在也深刻影响T细胞活化。CAR通过使用TCR/CD3zeta信号传导部分激活T细胞来模仿TCR。但是，CART细胞与常规的α/βT细胞有很大的不同，因为：（i）CART识别独立于靶MHC和CD8表达的抗原；（ii）CART仅通过zeta链激活，而不会涉及γ，δ和ε链；（iii）在CART中包含了共刺激信号。尽管CART和常规T细胞之间存在差异，我们的发现发现，降低CAR对“天然”高亲和力范围（-0mmol/L）的亲和力可提高CART对抗原高表达靶标的活性，这与常规方法的发现是一致的其最佳活化的T细胞需要“天然”亲和力范围内的TCR亲和力。如上所述，总体下降TCR/pMHC的亲和力导致针对高亲和力TCR的TCR与低密度pMHC的串联接触得以改善。同样，我们在当前的研究中发现，高亲和力的CART细胞显示出针对低水平靶抗原的改善的活性，这可能是由于CAR/抗原相互作用的结合半衰期缩短以及由于整体亲和力降低而导致的序列参与所致。因此，T细胞从高亲和力的CAR接收到的对足够低的表面抗原的信号可能与从低亲和力的CAR接收到的对高表面抗原的信号相同。

我们的研究存在一些局限性，需要在第一阶段的初步试验中进行评估。这包括ErbB和EFGR表达的细胞间差异（40），以及炎症情况下可能发生的未知变异。此外，尽管我们已经证明亲和力调节可以增加ErbB和EGFR的治疗指数，但是这是否是一种通用策略仍然未知。除了scFv亲和力以外，还需要根据具体情况进行检查的其他变量包括目标表位的位置，铰链的长度和信号传导域的性质（、4）。

总而言之，ErbB和EGFR以前被认为是CART细胞不可消耗的靶标。鉴于ErbB和EGFR的表达失调经常发生在多种人类癌症中，包括乳腺癌，胶质母细胞瘤，肺癌，胰腺癌，卵巢癌，头颈鳞状细胞癌和结肠癌，因此我们的发现具有重要的临床意义。我们的策略不仅有可能改善针对经过验证的靶标的CAR的安全性和临床结果，而且还可以将靶标的靶标毒性扩大到以前无法用CART细胞进行药物治疗的靶标。更普遍地，我们的发现表明，可以通过使用亲和力调节的scFv设计多种常见癌症来设计更安全，更有效的CAR。

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