人卵巢癌相关外泌体或可成为可逆性T细胞反

2019-3-7 来源:本站原创 浏览次数:

摘要:作者从卵巢癌患者腹水中分离出外泌体,作者发现将T细胞和这些肿瘤相关外泌体混合后,发现外泌体抑制了T细胞多种活化活动,包括NFκB和NFAT入核,CD69和CDa的上调,细胞因子的产生和细胞增殖。并且,I类MHC依赖的病毒特异性CD8+T细胞的活性也被抑制了,这些抑制发生后,T细胞存活率并没有降低,而且抑制的发生恰好是在和外泌体共培养以后。不过外泌体介导的T细胞抑制是短暂的、可逆的,当外泌体被移除以后,T细胞能重新“恢复活力”。肿瘤相关外泌体有免疫抑制能力,并且可能成为一个治疗的靶点,对其的封锁能加强那些“安静T细胞”的抗肿瘤反应

Fig.1.Characterizationofextracellularvesiclesisolatedfromhumanovarianascitesfluid.

对卵巢癌病人腹水进行超速离心,得到囊泡,用透射电子显微镜(TEM)验证其超微结构和大小,用草酸铀酰对其染色,表现为均匀的球形,膜结合的颗粒,与外泌体的形态一致(Fig.1A)

正交生物物理技术,如纳米粒子跟踪分析(NTA)和荧光各向异性被用来确定囊泡的大小和层状。囊泡的NTA分析表明其尺寸分布为50-nm(Fig.1B)

通过用二苯基己三烯(DPH)标记这些囊泡来分析这些囊泡的层状性;使用荧光各向异性测量不同温度下的脂质顺序和动力学(图1C)

发现五种外泌体标记蛋白(CD81,Tsg-,Flotillin-1,EpCAM和膜联蛋白V)在囊泡中丰富;检测到另外两个标记CD63和Alix,但量比较少(图1D)

证明了这些腹水中的这些囊泡的确是外泌体

之前就有报道称肿瘤患者腹水外泌体能抑制T细胞活力,但他们使用的是非特异性的一种CD3、CD28磁珠固定抗体加强模型,但外泌体可能仅仅只结合CD3或CD28的一种,为什么肿瘤腹水来源的外泌体的抑制抗原诱导T细胞活力的能力都相似呢?

Fig.2.ExosomesinhibitthenucleartranslocationofNFATandNF?Bfollowingactivation.

为了解决这个问题,作者使用了已经装载了肽链,能够结合TCR并激活T细胞的的MHCI类聚合体

将正常捐献者的EBV特异性T细胞(Fig.2A,B)或CMV特异性T细胞(Fig.2C,D)在零度(对照组)或常温下与MHCI类聚合体孵化,加用或不加外泌体。T细胞的活性用NFAT入核能力和细胞因子的产量确定,用成像流式细胞仪确认T细胞的NFAT入核能力,发现只有在常温、没有肿瘤外泌体、有适当肽链的T细胞的NFAT才能从胞质入核

为了更好的理解外泌体介导的T细胞抑制的动力学和耐久性,作者研究了T细胞活化的早期和晚期终点

T细胞加或不加外泌体孵育2h,并用特异性CD3、CD28抗体刺激,通过共聚焦显微镜监测NFAT和NFκB入核情况判断T细胞早期活力,作者发现只要有外泌体参与,NFAT的入核能力都被抑制了(Fig.2E)

NFκB的入核能力也被抑制了(Fig.2F)

Fig.3.ExosomesinhibittheactivationanddegranulationofTcells.

我们接下来检测外泌体对T细胞晚期活化的影响(通过检测CD69的上调)

将被刺激过的T细胞加或不加外泌体孵化,用流式筛选出CD3+CD4+或CD3+CD8+T细胞的CD69表达情况,发现相对控制组,加用肿瘤外泌体孵化2h后的CD4+(Fig.3AandB)和CD8+T(Fig.3C-D)细胞的CD69都明显下调了。但流式发现加或不加外泌体,T细胞的活性没有显著差异

用CDa抗体标记脱颗粒的CD8+T细胞

活化6小时以后,相比对照组,加了外泌体的CD8+T细胞CDa表达明显降低(Fig.3E-F)

Fig.4.ExosomesinhibitT-cellproliferationinresponsetopersistentstimulation.

作者接下来尝试确定是否可以通过持续激活来克服或逆转外泌体的抑制,作者对T细胞持续刺激的同时,加或不加外泌体,通过CTV标记细胞的荧光密度计数细胞的增殖能力

与预期一样,在持续刺激下,外泌体仍能明显抑制,但不清除T细胞增殖能力(Fig.4A-B)

Fig.5.InhibitionofT-cellactivationisassociatedwithexosomebinding

用CTV标记外泌体,再用流式检测T细胞,发现有25%的T细胞显示出中等荧光强度,大约5%的T细胞显示出高荧光强度,结合外泌体越多的T细胞能力越低(Fig.5A-5C)

Fig.6.Exosome-mediatedinhibitionofTcellsisreversible

为了确定肿瘤相关外体对T细胞活化的抑制是否是可逆的,我们在存在或不存在外泌体的情况下将被刺激的T细胞孵育。通过测定NFκB的核易位(图6A)或细胞内IFNγ的产生来测量激活效应(图6B)。

正如所料,在外泌体存在的情况下,我们看到这些T细胞中两个激活终点(NFκB入核,IFN-γ)都有明显的抑制作用。然后将这些细胞在不存在刺激和外来体的情况下休息24或48小时,发现这些细胞重新“复活”了。当使用NFκB易位作为终点时,我们观察到先前由外泌体抑制的T细胞中活化潜力的完全恢复(图6A-6B)。

我们得出结论:在用外来体2小时的脉冲期间发生的对T细胞活化的抑制是可逆的

结论:总的来说,这些结果显示肿瘤相关的外泌体与T细胞快速结合并被内化,并且结合/内化与T细胞活化的停滞相一致,并且不影响存活力。这种T细胞停滞是短暂的,可以通过去除免疫抑制性外泌体来逆转。这表明肿瘤相关的外泌体代表潜在的癌症治疗靶点。

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