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人参皂甙单体Rh2对人脑胶质瘤细胞U25

2017-3-6 来源：本站原创浏览次数：次

导读：用GS-Rh处理人脑胶质瘤U51细胞,采用MTT法检测U51细胞增殖抑制率,流式细胞仪和AnnexinVFITC/PI双染法观察。

　　人参皂甙单体Rh对人脑胶质瘤细胞U51增殖和凋亡的影响及其机制探讨　　张继全,邱建武,关宁,张晓健

　　(辽宁医学院,辽宁锦州)

　　摘要:目的　观察人参皂甙单体Rh(GSRh)对人脑胶质瘤U51细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其机制。

　　方法:用GS-Rh处理人脑胶质瘤U51细胞,采用MTT法检测U51细胞增殖抑制率,流式细胞仪和AnnexinVFITC/PI双染法观察U51细胞凋亡情况,TRAPELISA法检测U51细胞端粒酶活性,RTPCR法检测U51细胞人端粒酶逆转录酶hTERTmRNA的表达。结果5、10、0、40、80g/mlGSRh组U51细胞增殖抑制率分别为0.4%、3.19%、45.09%、57.37%、73.8%。根据细胞增殖抑制曲线计算出IC、IC、IC值分别为9.7、5.、.4μg/ml。FITC和PI荧光双参数点图显示实验组细胞分布区域与对照组相比出现明显改变,随着药物浓度的增加,早期凋亡、晚期凋亡或坏死的区域细胞数量逐渐增多。9.7、5.、68.4μg/mlGSRh处理1、4、48、7h后U51细胞端粒酶活性随GSRh浓度增加和作用时间的延长而降低。浓度为5.g/mlGSRh作用4、48、7h的U51细胞hTERTmRNA与actin灰度值比为0.±0.、0.±0.、0.±0.,对照组为0.±0.。作用48、7hU51细胞hTERTmRNA与actin灰度值比与对照组相比P均0.05;作用48、7h者相比P0.05。结论　GSRh能够诱导人脑胶质瘤U5l细胞凋亡,抑制U5l细胞增殖。其机制与其抑制hTERT基因表达,降低端粒酶活性有关。

　　关键词:人参皂甙单体Rh;胶质瘤;细胞增殖;细胞凋亡;端粒酶;人端粒酶逆转录酶

　　中图分类号:R.41 　　文献标志码:A 　　文章编号:X()

　　EffectandmechanismofginsenosideRhonhumangliomaU51cellproliferationandapoptosisZHANGJiquan,QIUJianwu,GUANNing,ZHANGXiaojian(LiaoningMedicalUniversity,Jinzhou,P.R.China)Abstract:Objective　ToobservetheeffectandmechanismofginsenosideRh(GSRh)onhumangliomaU51cellproliferationandapoptosis.Methods　HumangliomaU51cellsweretreatedwithGSRh,theinhibitoryeffectwasexaminedwithMTT.StainingwithAnnexinVFITC/PIandflowcytometryanalysiswereusedtodetecttheapoptoticcells.

　　TRAPELISAwasusedtodetectedtelomeraseactivityandRTPCRwasusedtodetecttheexpressionofhTERTgene.Results　Theapoptoticratewas0.4%inthegroupwith5g/mlGSRh,3.19%inthegroupwith10g/mlGSRh,45.09%inthegroupwith0g/mlGSRh,57.37%inthegroupwith40g/mlGSRh,73.8%inthegroupwith80g/mlGSRh.ThevalueofIC,IC,ICwere9.7,5.,68.4g/mlrespectively.FITCandPIfluorescencedualparameterpointmapshowedthattherewasasignificantlychangebetweentheregionaldistributionofexperimentalcells 　　文献报道人参皂甙单体Rh(GS-Rh)具有较强的抗肿瘤生物活性,对卵巢癌、黑色素瘤、神经胶质瘤、白血病以及人肺腺癌等肿瘤细胞的增殖具有明显的抑制作用。国外研究表明,这种抗肿瘤作用与其诱导肿瘤细胞凋亡有关[5]。国内相关报道较少。年3～7月,我们检测了GSRh对胶质瘤U51细胞增殖和凋亡及端粒酶活性、人端粒酶逆转录酶hTERTmRNA表达的影响。现报告如下。

　　1材料与方法

　　1.1　材料　人脑胶质瘤U51细胞株,RhDMEM培养基,胎牛血清,MTT、DMSO、RTPCR试剂盒,AnnexinVFITC/PI双染试剂盒,TRAPELISA试剂盒,多功能电泳仪,PCR仪,Biorad凝胶成像系统,流式细胞仪。

　　1.　方法

　　1..1　U51细胞增殖抑制率的测算　采用MTT法。取对数生长期U51细胞接种于96孔培养板(1×)孔。加入终浓度分别为0(对照组)10、0、40、80g/ml的GSRh,每孔设4个复孔。37℃、5%CO孵箱中培养48h。每孔加入5mg/mlMTT溶液0l,继续培养4h后加入DMSO酶联免疫检测仪nm波长处测定吸收度OD值。细胞增殖抑制率=(1-加药组OD值/对照组OD值)×%。绘制细胞增殖抑制曲线图,横坐标为GSRh浓度,纵坐标为细胞抑制率,计算IC30IC50IC70。

　　1..U51细胞凋亡情况的观察采用AnnexinV-FITC/PI双然法和流式细胞术。收集浓度为IC30、IC50、IC70的GS-Rh作用48h的实验组和对照组U51细胞。调待测细胞浓度为1×/ml。去1ml细胞，0r/min，4℃离心10min，弃上清，再加入1ml的冷PBS同法离心，弃上清，将细胞重悬于00μ1BindingBuffer中，加入10μ1AnnexinV-FITC和5μlPI,轻轻混匀后避光4℃反应30min;最后加入μlBindingBuffer用流式细胞仪观察细胞凋亡情况。

　　1..3U51细胞端粒酶活性的检测采用TRAP-ELISA法。收集药物浓度为IC30IC50IC70作用1,4,48，7h的实验组和对照组51细胞，分别加入00μl细胞裂解液，取上清液并根据试剂盒提供的引物和预设PCR程序进行端粒序列扩增，将扩增产物顺序进行杂交，显色处理后室温放置0min，最后加入μl反应终止液,制备的样本用酶联免疫检测仪分别测nm和nm波长的OD值，两者差值代表细胞端粒酶活性。以U51细胞提取液于65℃加热10min后为阴性对照，以人胚肾93细胞株端粒酶提取液为阳性对照。

　　1..4U51细胞hTERTmRNA的检测，采用RT-PCR法。分别取对照组和浓度为IC50GS-Rh作用4,48,7h的实验组U51细胞，提取各族细胞总RNA，逆转录制备cDNA，然后进行聚合酶链反应(PCR)。操作按试剂盒说明书进行。利用图像分析软件GeneTools分析各组hTERT、β-catin两条基因条带的灰度比。

　　1..5统计学方法采用SPSS13.0统计软件。数据用x±s表示。两样本均数比较采用配对t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

　　.结果

　　.1U51细胞增殖抑制率5、10、0、40、80μg/mlGS-Rh组U51细胞增殖抑制率分别为0.4%，3.19%，45.09%，57.37%，73.8%。根据细胞增殖抑制曲线计算出IC30、IC50、IC70值分别为9.7、5.、68.4μg/ml。

　　.U51细胞凋亡情况FITC和PI荧光双参数点图显示对照组细胞主要分布在坐下象限的活细胞去，实验组细胞分布区域出现明显改变，随着药物浓度的增加，早期凋亡，晚期凋亡或坏死的区域细胞数量逐渐增多。

　　.3U51细胞端粒酶活性对照组和9.7、5.、68.4μg/mlGS-Rh组U51细胞培养0、1.、4、48、7h端粒酶活性见表1.

　　.4U51细胞hTERTmRNA浓度为5.μg/mlGS-Rh作用4、48、7h的U51细胞hTERTmRNA于与β-actin灰度值比为0.±0.、0.±0.、0.±0.，对照组为0.±0.。作用48、7hU51细胞±于β-actin灰度值比与对照组相比P均0.05;作用48、7者相比P0.05。

　　3讨论

　　人参为五加科多年生草本植物,是有着近几千年应用历史的名贵中药。GSRh是从人参中分离得到的原人参二醇型低糖链皂苷单体。大量研究表明,GSRh在肿瘤的预防和治疗方面具有较强的活性,GSRh的抗肿瘤作用较为广泛,既可阻滞细胞周期,诱导癌细胞凋亡和抑制肿瘤的生长或诱导细胞分化使其逆转,抑制肿瘤的转移,影响和调节免疫功能,增强机体对疾病的抵抗能力,从而抑制肿瘤的能抑制hTERT生长,还可增强抗癌药的药效[1]。GSRh用具有多靶点、多效应的特点,同时其不良反应少,不易产生耐药性,是近年来研究的热点。肿瘤主要发生机制之一是细胞正常的有限生命周期缺陷,使细胞永生化。端粒酶的激活是细胞永生化的关键步骤.无限增殖和凋亡抑制是肿瘤U51细胞凋细胞共有的特征,由此引起的细胞异常蓄积是肿瘤抑制发生、发展的中心环节[3]。Kyo等[4]研究表明hTERT是端粒酶活性的限制性成分,hTERT的表达与端粒酶激活和肿瘤发展存在着密切关系。本研究用机制的研究进展[J].结果显示,在体外GSRh对人脑胶质瘤U51细胞oncologist:cellular增殖有明显抑制作用,IC50为5.μg/ml。通过流式细胞仪检测细胞凋亡的荧光双参数点图发现,各实验组细胞分布区域发生了明显变化,并且随着药基因表达对其增殖及物浓度增加活细胞的分布区域细胞数量逐渐减少,而凋亡早期、凋亡晚期或坏死区细胞数量相应增多。表明GSRh能够抑制人脑胶质瘤U5l细胞增殖,诱导U5l细胞大量凋亡,且凋亡早期细胞数量尤为胞hTERT表达及端明显。端粒酶的活性表现是人端粒酶逆转录酶hTERT以人端粒酶RNAhTR为底物合成端粒序列维持端粒在一定长度,稳定染色体结构,使细胞成为永生性细胞[5]。hTERT是端粒酶活性的限速因素,在端粒酶阳性的肿瘤中常见hTERT高表达。hTERT基因表达可以反映端粒酶活性与hTERTmRNA水平,端粒酶激活与凋亡调控失控同为肿瘤恶性转化的早期事件[7]。本研究结果显示,GSRh对人脑胶质瘤细胞的抑制作用。GSRh可以抑制细胞的端粒酶活性变化,实验组随着时间延长和剂量加大端粒酶活性逐渐降低,并呈现时间和剂量依赖性关系,通过药物抑制端粒酶催化亚单位hTERT的表达,可降低端粒酶活性,最终导致肿瘤细胞死亡,从而达到治疗肿瘤的目的。hTERTmRNA水平与端粒酶活性密切相关,hTERT的激活对肿瘤细胞中端粒酶活性的激活是必需和足够的,hTERT的表达是端粒酶活化和细胞癌变的限速步骤[8]。本实验通过琼脂糖凝胶电泳获得hTERT基因扩增条带表明,GSRhmRNA的表达水平,图像分析软件显示实验组与对照组相比较扩增条带灰度比有显著性差异,并随着药物作用时间的延长hTERTmRNA的表达量越来越少。因此,利用hTERT启动子的癌细胞相对特异的转录活性,可将其作为肿瘤基因治疗靶标[9]综上所述,GSRh亡,抑制其增殖。其机制可能与hTERT基因表达,降低端粒酶活性有关。GSRh促进人胶质瘤U51细胞凋亡,抑制其增殖。其机制可能与GSRhhTERT基因表达,降低端粒酶活性有关。