JEM中性粒细胞外捕获网促进卵巢癌转

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iNature

中性粒细胞是宿主抗病原菌感染的第一道防线，在癌症发展进程中发挥重要的作用，其在癌症的进程中展现了双刃剑的作用。虽然中性粒细胞有抗肿瘤的作用，但是越来越多的研究表明其在促进肿瘤的转移发挥重大的作用。多种肿瘤细胞和癌细胞也会分泌G-CSF活化中性粒细胞，刺激氧代谢并增加血小板的聚集从而形成微血管中的微血栓。部分的临床数据表明，循环中性粒细胞数量增加和G-CSF含量的上生是癌症患者不良预后的标志之一，尤其在某些恶性肿瘤，例如肺癌和胃癌。

研究表明，中性粒细胞的功能和表型会发生不同的极化在肿瘤发展的不同时期。早期阶段，瘤内的中性粒细胞(TAN)表现为抗肿瘤的N1型，主要分泌IL1b、IL6以及TNF-a等炎性细胞因子，非特异的杀伤肿瘤细胞而起到抗肿瘤的效果。而在晚期阶段，在肿瘤内的免疫抑制的微环境产生的细胞因子作用下，逐渐转型为促肿瘤的N2型，N2型中性粒细胞尤其是在TGF-β、CXCL2/5/7、IL8等作用下，促进了肿瘤的生长和转移。肿瘤相关中性粒细胞(TAN)诱导的NE的表达和释放能够介导E-钙黏蛋白(E-cadherin，E-cad)的降解，促进的肿瘤的侵袭。

中性粒细胞外捕获网（NETs）于年首次被ArturoZychlinsky定义，相关成果发表在science期刊上，其主要功能就是捕获和杀死病原菌。越来越多的报道表明，NETs也在抗病毒感染、全身性的炎症反应、肺部疾病、自身免疫病、血栓形成以及肿瘤转移等方面发挥作用。尤其是近几年，越来越多的研究表明NETs参与到肿瘤的转移。肿瘤切除手术之后患者的血液含有NETs，而且NETs丰度越大肿瘤复发的风险就越高，细菌感染导致的NETs会促进肿瘤的复发和转移。NETs诱发的癌症个体外周器官的炎症状态也可能是导致肿瘤转移的一个重要因素。

中性粒细胞外捕获网(NETs)

年12月19日，来自休斯顿德克萨斯大学MDAnderson癌症中心HonamiNaora团队，在J.Exp.Med.发表了题为“Neutrophilsfacilitateovariancancerpremetastaticnicheformationintheomentum”的研究论文，该论文研究表明中性粒细胞在网膜的定植是卵巢癌转移的先决条件之一。卵巢肿瘤释放的炎性因子刺激中性粒细胞变成NETs样状态并捕获循环的卵巢癌细胞促进肿瘤的转移，在转移前的荷瘤小鼠的网膜和转移早期的女性中均检测到NETs的存在。PAD4作为NETs形成的必不可少的酶，不论是PAD4-/-小鼠或者使用PAD4的抑制剂均能阻断NETs的形成，也可以减少卵巢癌细胞在网膜的定植。因此，NETs的形成有利于形成转移的一个微环境，为肿瘤的转移提供了温床，阻断NETs可能是阻止卵巢癌网膜转移的手段之一。

研究表明，卵巢癌细胞定植于网膜的能力在缺乏T细胞，B细胞或者NK细胞的小鼠和野生型小鼠相差无几，说明非淋巴细胞在卵巢癌的偏向性中发挥重要的作用。巨噬细胞是主要的先天免疫细胞之一，其能够分泌细胞因子促进卵巢癌的血管生成和免疫逃逸，然而其不能完全解释卵巢癌细胞的趋向性。因为巨噬细胞几乎占腹膜液细胞含量的60%，而且在整个腹腔的多个部位都有大量的巨噬细胞。骨髓来源的中性粒细胞作为病原体感染和组织损伤的第一道防线，通常情况下，其在网膜以及腹膜液中的丰度较低（1%），只有在腹膜感染和损伤时才会募集到腹部，并在网膜上形成白色斑点。最近的研究表明，网膜中募集的中性粒细胞是卵巢癌细胞定植不可或缺的。

研究人员，使用稳定表达LuciferaseandGFP的鼠卵巢癌细胞系ID8，分别采用原位接种和腹腔注射的方式研究其转移的情况。结果表明，ID8无论采用何种方式接种野生型C57小鼠或者免疫缺陷的NSG小鼠，卵巢癌细胞主要转移在大网膜上。并且通过免疫荧光实验表明，在转移的早期阶段，细胞主要在网膜的白色斑点附着，而很少见于脂肪组织。同样的结果在患有卵巢癌的女性患者临床标本中。结果表明，卵巢癌细胞趋向于定植在网膜中，尤其是乳白色斑点内，并且不受淋巴细胞的影响。

卵巢癌细胞趋向于定植在网膜并不受淋巴细胞缺失的影响

之后，研究人员发现，ID8细胞原位接种后第3周可以明显检测到，而大网膜的转移需要到第4周。接种肿瘤的小鼠网膜的中性粒细胞在第三周明显升高，巨噬细胞没有明显变化。通过免疫荧光共定位发现，中性粒细胞主要聚集在白色斑点附近。与网膜相反，其他腹膜组织并没有明显的中性粒细胞富集现象。同时，与小鼠实验一致，在卵巢癌转移的网膜组织样本中，可以检测到显著升高的中性粒细胞弹性蛋白酶。结果表明，网膜中增长的中性粒细胞出现在卵巢癌的转移之前。

随后研究人员检测了中性粒细胞的耗竭是否可以减少卵巢癌细胞网膜转移的现象。通过原位接种卵巢癌细胞，三周后随机分组并进行anti-Ly6G抗体以及同型对照抗体进行处理，通过流式检测外周血细胞中性粒细胞明显降低，但是对其他细胞没有影响。中性粒细胞耗竭对原位肿瘤的大小没有影响却明显降低了网膜转移的肿瘤，结果表明中性粒细胞促进了卵巢癌在网膜的转移。

为了探究卵巢癌细胞对中性粒细胞的影响，研究人员采用，人卵巢癌细胞系ES2培养上清与中性粒细胞共孵育，并明显观察到了与PMA刺激的中性粒细胞一样的NETs。同样的结果也可以在ID8上清刺激的小鼠骨髓来源的中性粒细胞中观察到。与此同时，中和肿瘤培养上清中的IL-8，GROαandGROβ，G-CSF均能够减少NETs的发生，说明卵巢癌细胞分泌的细胞因子促进了中性粒细胞外捕获网NETs的形成。

研究人员随后在体内检测了接种卵巢癌细胞后，网膜的NETs形成情况。与对照组相比，ID8原位接种组的网膜中性粒细胞形成NETs的比例远远高于对照组，并且可以在网膜内检测到Ly6G+和cit-H3共定位的信号。同时，在卵巢癌患者样本中MPO+cit-H3+的细胞明显增高。说明早期的卵巢癌肿瘤诱导了网膜NETs的形成。

NETs在体内主要是捕获并杀伤病原菌，从而达到保护机体。研究人员，通过PMA或者ID8细胞上清诱导NETs的发生，并加入肿瘤细胞，结果显示肿瘤细胞大量的粘附在NETs阳性的中性粒细胞周围。为进一步探讨NETs与卵巢癌细胞的作用，研究人员采用PAD4-/-的中性粒细胞，其并不能诱导NETs的形成。结果显示，ID8细胞上清刺激的PAD4-/-的中性粒细胞并没有产生NETs，同时也没有粘附肿瘤细胞。

研究人员在PAD4-/-和PAD4+/+小鼠体内检测了卵巢癌的网膜转移情况，流式结果表明二种小鼠网膜的中性粒细胞数量没有差异，但是原位接种ID8细胞后，PAD4-/-网膜NETs样细胞明显减少。原位肿瘤大小在二种小鼠体内增长并没有差异，而网膜转移的肿瘤在PAD4-/-小鼠体内显著降低，说明卵巢癌转移取决于网膜的NETs形成。

随后研究人员测试了多种NETs的抑制剂，CI-amidine，GSK和DNase，结果表明这些抑制剂均能够有效的抑制NETs的形成。使用GSK并不影响中性粒细胞进入网膜和卵巢癌细胞的增殖，却能够有效的抑制NETs的形成，并降低卵巢癌的网膜转移，进一步说明NETs丰度的降低减少了卵巢癌的转移。

卵巢癌细胞对中性粒细胞的影响

总之，本研究深入分析了卵巢癌肿瘤网膜转移的潜在机制之一，中性粒细胞渗透进入网膜受到早期卵巢癌细胞分泌的细胞因子刺激并形成NETs状态，捕获进入体液循环系统的卵巢癌细胞促进了卵巢癌的网膜转移。而通过抑制NETs形成所必须的PAD4酶的功能可以有效的抑制肿瘤的转移。该研究为进一步改善乱猜的治疗和常见的并发症提供了新的见解和思路，同时本文也存在一定局限可以做进一步研究，比如中性粒细胞捕获肿瘤细胞的机制是否和肿瘤的免疫微环境相关，靶向PAD4酶的治疗是否会影响机体对抗病原菌的感染。

卵巢癌网膜转移的可能机制

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