学而思外泌体在卵巢癌诊断及治疗中的研

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作者：张玉颖，尚松，阎磊，夏蛮

单位：中南大学湘医院医院

卵巢癌（ovariancancer）是影响全世界众多女性的最致命的妇科恶性肿瘤，其早期症状隐匿，超过70%的患者就诊时已为晚期。卵巢癌的早期诊断对疾病的治疗有巨大的积极作用，若早期诊断则5年生存率可高达90%。目前卵巢癌的主要治疗方法是肿瘤细胞减灭手术（CRS）和以紫杉醇及铂类为基础的化疗。尽管传统治疗方法逐步发展，但卵巢癌的复发及化疗耐药问题仍然严峻，这对于患者的生存及预后都极为不利。外泌体是由多泡体胞外分泌生成的，其参与介导许多体内生理病理过程，包括细胞间通讯、免疫系统功能、发育和分化、神经元功能、细胞信号传导等。越来越多的研究表明外泌体在肿瘤发生发展中充当重要角色。本文从外泌体在卵巢癌诊治中的作用及转化应用、外泌体参与构成卵巢癌肿瘤微环境的形成、卵巢癌的化疗耐药及外泌体耐药、外泌体与卵巢癌靶向治疗四个角度进行综述。

01/外泌体概述

Johnstone等首次发现在绵羊网织红细胞的体外培养过程中释放了囊泡并将其命名为外泌体（exosomes）。外泌体是一种由真核细胞的胞内多泡体与胞膜融合后分泌到细胞外环境中的膜性小囊泡，大小通常介于40-nm。用透视电子显微镜（TEM）标准负染色方法可以观察到具有明显脂质双层的圆形囊泡以及具有特征性杯形的变形外泌体。在外泌体内发现了数以千计的mRNA和数百种miRNA。有研究表明，星形胶质细胞和成胶质细胞瘤的外泌体中竟含有线粒体DNA(mtDNA)。外泌体含有许多蛋白质，除了较为熟知的特征蛋白如四跨膜蛋白（CD63、CD81、CD82）、热休克蛋白（Hsc70），还有阳离子依赖性甘露糖-6-磷酸受体、受体表达增强蛋白6、过渡性内质网ATP酶等。另外，脂质、长链非编码RNA(lncRNAs)也是外泌体的生物活性分子。许多类型的细胞包括树突状细胞、血小板、肿瘤细胞等均可分泌外泌体，甚至在肿瘤患者的血浆、尿液及腹水中也可分离出外泌体。

外泌体装载着各种分子，同时也具有交换组分（核酸、脂质、蛋白质）和充当信号传导载体的能力，参与介导炎症免疫反应、细胞存活与凋亡、血管新生、血栓形成、自噬、细胞间信号通讯等生物学过程。不同来源的外泌体均含有其来源细胞的胞膜和胞质蛋白成分，它较易与邻近细胞的胞膜发生融合，进而将一个细胞的胞膜及胞质蛋白传递给另一个细胞，在不同细胞间进行信息传递。细胞间通讯对于维持多细胞生物中的细胞功能和组织稳态是必要的，外泌体介导的细胞间通讯在癌症发展过程中重塑肿瘤微环境和形成转移前的生态位是必需的，它们可以影响肿瘤的进展、转移和治疗效果。外泌体介导的信号传导可通过递送各种各样的生物大分子来诱导炎症反应，涉及肿瘤发展、免疫监视等生理病理过程。在发育过程中的许多细胞间通讯是由经典的配体-受体相互作用介导的，由于其膜质性质，外泌体成为膜相关信号蛋白的天然载体。

02/外泌体在卵巢癌诊治中的作用及转化应用

早期卵巢癌的预后明显优于晚期，所以早期诊断尤为重要。肿瘤学比其他任何医学领域都受益于核酸测序技术和基因组分析的最新进展，基于下一代测序的癌细胞RNA种群研究揭示了其在癌症中的作用。外泌体作为液体活检的一种方式也被考虑用于癌症的早期诊断和随访监测，已经有大量证据表明外泌体蛋白质、外泌体miRNA是用于卵巢癌诊断和预后的生物标志物，但是关于外泌体环状RNA在卵巢癌领域的相关研究较少，随着环状RNA成为新近肿瘤研究热点，其对于癌症诊治中的巨大潜力也被渐渐发掘。环状RNA(circRNA)是具有5′至3′极性和多腺苷酸化尾部的共价闭环结构的一类内源性非编码RNA。CircRNA通过“外显子跳跃”“lariat中间体”“直接反向剪接”形成环化。起初它被认为由错误拼接产生而没有重视。随着转录组测序技术（RNA-seq技术）的开发，circRNA的相关研究已经成为了研究热点。

外泌体中存在circRNA，这在一系列癌细胞系中得到了证实，包括肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌和卵巢癌等。借由生物信息学软件，已经发现circRNA在各种细胞类型和癌症中的差异表达，各种circRNA在癌症中发挥着重要作用。有研究证实circRNA在肿瘤类型之间的差异表达比mRNA更显著。编码差异表达的环状RNA基因丰富了与癌症相关的以及细胞粘附信号通路，这暗示了circRNA在癌症发生和发展中的差异表达的因果关系。Ning等的研究表明circRNA与卵巢癌的预后有关，具有低circEXOC6B表达的上皮性卵巢癌患者总生存期显著短于具有高表达患者的总生存期。此外，具有低circN4BP2L2表达的上皮性卵巢癌患者其无进展生存期显著低于具有高circN4BP2L2表达的患者。CircEXOC6B和circN4BP2L2被认为可作为上皮性卵巢癌的新型预后生物标志物。除了circRNA，Kim等研究发现在卵巢癌患者的血清中，外泌体miRNA-和miRNA-c的表达显著升高，血清外泌体miRNA-和miRNA-c有望作为卵巢癌术前诊断的有前途的生物标志物。在血液中裸露的RNA会迅速降解，由于外泌体的保护，外泌体内分子含量却仍可保持稳定且在其中富集。外泌体甚至可以在各种条件（冷冻、冷藏或解冻）下保存数月甚至数年。这些发现促使我们考虑外泌体中生物分子可能有助于癌症的早期发现及其作为癌症检测潜在生物标志物的可能性。

与良性肿瘤或正常人相比，卵巢癌患者血浆中的外泌体蛋白水平更高，并且癌细胞系、肿瘤组织、血浆中的外泌体内miRNA也被证明有差异表达。比如，Shen等发现卵巢癌血清外泌体中生物标志物Claudin4的表达水平与肿瘤分期呈正相关；Yang等从卵巢癌患者血清中提取外泌体，发现miR--3p在恶性程度高的上皮性卵巢癌组织中均有高表达，结果推测血清外泌体中的miR--3p可能是卵巢肿瘤诊断和预后的潜在生物标志物。生物活性分子可通过外泌体自胞内释放至循环系统，通过现有手段可以被检测，是一种非侵入性检测方法。与常规标本中检测到的生物标志物相比，外泌体具有出色的稳定性，且卵巢癌患者血浆中的外泌体量比正常人高三至四倍。外泌体所携带的物质具有肿瘤特异性，肿瘤来源的外泌体可以从所有体液中获得并具有将其与非癌症外泌体区分的特征，且与肿瘤的分期和预后有关，检测外泌体中的环状RNA、微小RNA、蛋白质等可以帮助卵巢癌的诊断和预后判断。对于早期诊断能极大改善生存率的卵巢癌来说，使用外泌体内容物进行早期诊断具有极大潜力，检测外泌体可作为区分良恶性肿瘤的辅助手段。

有研究表明，在细胞中circRNA可经由miRNA介导切割从而被清除，但仅限于特定序列，而外泌体是circRNA细胞清除的主要方式之一，这或许是外泌体差异调控circRNA分子水平，并通过一系列信号传导途径最终影响肿瘤侵袭性的机制之一。类似的，在一项直肠癌细胞circRNA表达谱的分析实验中，当比较突变体和野生型KRAS衍生的外泌体时，相对circRNA水平的变化与它们的线性mRNA宿主基因的变化不同步，癌基因突变降低了细胞中的circRNA表达，而外泌体参与了circRNA的复杂运输。某些circRNA在特定癌症中起促癌或者抑癌作用。一项探索circRNA与喉鳞状细胞癌（LSCC）连接分子机制的研究中，通过与正常组织对比和微阵列技术，研究人员在癌性组织中发现了个被上调的circRNA和个被下调的circRNA，这些失调的circRNA或许参与了癌变。其中circRASSF2在肿瘤组织及血清外泌体中显著上调。该研究证明circRASSF2在癌症发展中起促癌作用，敲除其可以显著抑制体内肿瘤的生长。由此可见，circRNA在肿瘤类型之间显著差异表达与外泌体的复杂运输有着密不可分的关系，研究外泌体装卸生物分子的机制从而以其为切入点调控外泌体内分子水平并最终抑制肿瘤生长，这或许可以为卵巢癌的抑癌治疗提供新思路。

ExoRBase是一个专门储存来源于人血外泌体RNA-seq（转录组测序技术）数据分析的环状RNA(CircRNA)、长非编码RNA(LncRNA)和信使RNA(MRNA)的数据库。ExoRBase的第一个版本包含个circRNA、个lncRNA和个mRNA。这为我们进行外泌体研究提供了巨大便利。虽然肿瘤来源的外泌体circRNA已在多种肿瘤类型中被鉴定，但是目前卵巢癌领域的相关报道较少，卵巢癌来源外泌体中环状RNA的特定功能尚未明晰，这是值得探讨并极具潜力的方向，我们需要更大样本的实验来验证并阐述外泌体circRNA在卵巢癌肿瘤发生中的作用调节机制。

03/外泌体参与构成卵巢癌肿瘤微环境的形成

大多数卵巢癌在晚期伴有播散性腹腔内转移，与原发肿瘤本身相比，转移性疾病更致命。卵巢癌进展或转移的机制亟待研究。卵巢癌的晚期诊断限制了化疗及减灭手术的有效性，生存率大大降低。腹腔内扩散被广泛认为是上皮性卵巢癌转移的最常见途径，另一重要途径是血行转移，这两种方式都由细胞运动驱动，基质细胞参与。

在肿瘤转移过程中，转移前易于转移瘤细胞种植的微环境形成至关重要。肿瘤微环境由基质细胞(包括成纤维细胞、巨噬细胞、调节性T细胞、髓源性抑制细胞、内皮细胞、周细胞和血小板）、细胞外基质（ECM，由炎性细胞因子、趋化因子、基质金属蛋白酶、整合素和其他分泌分子组成）和外泌体构成。有研究表明含有大量肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的前体病变可能破坏正常的巨噬细胞相关发育过程，并有助于肿瘤细胞侵入周围基质。另外，Tlsty等发现影响基质细胞的特征性突变可能有助于上皮肿瘤的形成。如果正常的稳态条件被破坏，细胞周期停滞或诱导细胞死亡/分化程序将无法运行，假设异常信号持续存在，这将会导致细胞行为异常，产生对正常生理控制无反应的异质组织。

肿瘤微环境被认为在卵巢癌转移中扮演重要角色。外泌体是肿瘤微环境中重要成员之一，它通过旁分泌机制充当着细胞间通讯的关键媒介。在一项分析癌相关脂肪细胞（CAA）、癌相关成纤维细胞（CAF）和卵巢SKOV3癌细胞的实验中，结果显示网膜卵巢肿瘤（转移灶）及复发性卵巢癌表达的miR-21水平高于原发部位。更有趣的是，复发性或化学耐药性卵巢肿瘤细胞中miR-21表达水平的增加在体外比体内低得多，这表明肿瘤微环境中的基质细胞通过miR-21的直接转移或可溶性介质的转录增加卵巢癌细胞中的miR-21表达水平。肿瘤组织中最高水平的miR-21位于基质-上皮界面和侵袭前沿，这表明miR-21被相邻基质细胞分泌的介质上调或直接从邻近细胞转移。通过用荧光素亚酰胺（FAM）瞬时转染标记miR-21证实，miR-21通过外泌体从CAAs和CAFs转移到卵巢癌细胞。在大网膜肿瘤微环境中，由领近基质细胞来源的外泌体提供的miR-21可以改变转移性卵巢癌细胞的恶性表型(癌细胞运动和侵袭)，抑制基质来源外泌体miR-21的转移是治疗转移性和复发性卵巢癌的一种替代方式，这或许可以成为癌症治疗的新切入点。肿瘤微环境与肿瘤细胞间的作用是相互的，外泌体则充当了交通工具。一项关于卵巢癌进展的实验发现，人覆膜间皮细胞与含有circWHSC1的外泌体孵化后，N-钙黏蛋白和黏蛋白1被上调，E-钙黏蛋白被下调。E-钙黏蛋白下调降低了一个组织内细胞粘附的强度，导致细胞活动性增加。这可以转而允许癌细胞穿过基底膜入侵周围组织。与对照组相比，连续腹腔注射外泌体circWHSC1可以显著增加腹腔内肿瘤结节数量。由此可见，circWHSC1可以外来体的形式被腹膜间皮细胞吸收，进一步促进了肿瘤的腹膜植入及传播。

越来越多的证据表明，间充质干细胞（MSC）是肿瘤基质的潜在前体，可以作为外泌体抗癌药物的靶向递送载体。一项关于两种不同的卵巢癌细胞系和脂肪组织来源的间充质干细胞（ADSCs）的外泌体研究显示，经过来自卵巢癌细胞系的外泌体处理后的ADSCs，其α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）呈显著高表达，证明卵巢癌衍生的外泌体诱导ADSCs中肿瘤相关肌成纤维细胞标志物的表达，从而提供了肿瘤相关肌成纤维细胞在肿瘤微环境中肿瘤基质内MSC生成的可能性，这强烈暗示外泌体参与构成的肿瘤微环境在卵巢癌中的重要性。

肿瘤微环境是卵巢癌发展中的关键决定因素。已有多种证据表明，在瘤形成的背景下，上皮-间质转化（EMT）赋予癌细胞更高的肿瘤启动和转移潜能。另一项关于CAF的实验表明，来自肿瘤微环境中CAF所衍生的外泌体通过转化生长因子-β1触发卵巢癌细胞的迁移和侵袭。此外，与对照组相比，经过CAF外泌体处理的SKOV-3和CAOV-3细胞，其间质标志物(N-钙黏蛋白和波形蛋白)的表达升高，E-钙黏蛋白表达水平则降低，这表示成纤维细胞衍生的外泌体可以促进EMT。这不仅表示肿瘤微环境中的基质细胞可以参与到肿瘤的侵袭及进展中，并且，作为微环境中成分之一的外泌体可以被其所分泌，与之共同参与到肿瘤微环境的稳态失衡，从而导致疾病的恶性导向。

04/卵巢癌的化疗耐药及外泌体耐药

卵巢癌是与化疗耐药相关的复发率最高的肿瘤之一（50%的患者在5年内复发），这对卵巢癌化疗的有效性提出了根本性的挑战。肿瘤细胞通过多药耐药（MDR）逃避大部分常用化疗药物的毒性作用。肿瘤细胞表面有两类转运蛋白参与MDR的发生。一种是三磷酸腺苷结合盒转运蛋白超家族，它是一种需要能量的外排泵，具有从癌细胞中挤出毒性化疗药物的功能。另一类是溶质载体转运蛋白超家族，介导细胞对抗癌药物的摄取，耐药可能与转运蛋白活性降低有关。另外有研究也表明，参与药物和异种脱毒的代谢酶影响了药物反应和耐药性，例如谷胱甘肽S-转移酶（GST）与顺铂（CDDP）之间增加的结合反应决定烷化剂的抗性。烷化剂通过活性基团与DNA形成交叉联结结构，破坏DNA的结构与功能，这类药物由于直接损伤DNA，所以对细胞周期各个时相均有杀伤作用，属于细胞周期非特异性抗肿瘤药。随着近几年对细胞功能蛋白信号传导网络的深入了解，受体酪氨酸蛋白激酶(RTKs)被发现在对化学治疗剂中的反应中起重要作用。除此以外，还有细胞骨架组织、细胞凋亡和DNA修复等。

溶酶体的形态及分泌表型异常见于耐药细胞，这种异常在顺铂耐药细胞中同样存在。在一项卵巢癌细胞（8细胞和8/C13*5.25亚系）中溶酶体区室的研究中，首先将卵巢癌8/C13*5.25细胞反复暴露于顺铂，筛选出获得性耐药的卵巢癌细胞并连续培养保持其抗性。通过多步离心法提取活细胞中释放出的高质量外泌体，然后用PKH67Green(外泌体染料)标记并重新与原始细胞孵育。结果证实，外泌体能够重新进入起源细胞，耐药组外泌体含有显著增多的蛋白质（例如单克隆抗体LAMP1、转运蛋白MRP2，转运蛋白ATP7A和转运蛋白ATP7B），这可能与耐药时溶酶体的降解受损、细胞内蛋白质的运输异常而替代的一种蛋白丢弃途径有关，检测外泌体蛋白质或许是早期发现耐药或预测治疗反应的一条潜在途径。该研究也表明，外泌体参与调节化疗药物的细胞累积，外泌体途径或许是介导CDDP输出耐药的一种重要方式。相比敏感组，第一个小时内耐药组中外泌体中的铂输出量高出4.9倍，反倒是细胞中的CDDP负载只有敏感细胞的41%，显然细胞中大部分铂通过外泌体途径分泌至胞外。另一项证据是来自抗性卵巢癌细胞的外泌体可以诱导敏感细胞产生耐药，这进一步证实了外泌体可能充当抗性载体媒介并传递至非抗性细胞。

肿瘤来源的外泌体中富含miRNA，外泌体中miRNA与细胞的抗性表型和特异性负载有关。外泌体选择性负载某种分子（比如非编码RNA）并与细胞内的分子受体相互作用可以改变其耐药表型。已经发现外泌体miR-21赋予卵巢癌细胞的化学抗性并减少卵巢癌细胞凋亡的作用。全称凋亡酶激活因子（APAF1）是一种化疗耐药相关基因，转染CAAs和CAFs产生的外泌体可显著增加卵巢癌细胞中miR-21的表达同时降低APAF1的表达。另一项关于诱导卵巢癌细胞的细胞衰老从而增强对紫杉醇耐药性的实验表明，过表达的外泌体miR-通过影响肿瘤微环境，抑制邻近细胞的增殖，诱导细胞衰老，从而促进对紫杉醇的耐药性。我们从中可以推测，检测外泌体或许可以预测其抗癌药物疗效。

膜联蛋白是一类Ca2+结合蛋白，可与内细胞膜带负电荷的磷脂结合，参与胞吞、胞吐和膜-细胞骨架组织形成等各种细胞过程。Yin等发现膜联蛋白A3可能是卵巢癌的生物标志物和铂耐药的预后标志物，而一部分膜联蛋白A3通过外泌体分泌，并且该蛋白的表达水平显著调节外泌体的胞吐作用。可以推测，外泌体的含量、外泌体与生物活性蛋白相互作用并将其转移可能影响细胞的抗性表型。另外有研究表明，低氧诱导的外泌体可促成更具侵袭性和化学耐药性的卵巢癌表型。

05/外泌体与卵巢癌靶向治疗

靶向杀灭恶性肿瘤细胞是一个高效的方式，很多医学研究无非就是为了找出癌症的“靶点”，使精准治疗得以实现，减少治疗的毒副作用等。卵巢癌有多种潜在分子靶标，如BRCA1（breastcancer1）或BRCA2（breastcancer2）肿瘤抑制基因、血管内皮生长因子（VEGF）通路、PI3K/AKT/mTOR信号网络、肿瘤抑制因子p53、RAS/RAF/MEK/ERK途径、人表皮生长因子受体2（HER2）、miRNA、免疫途径等，但目前只有四种靶向药物被美国批准用于治疗卵巢癌：聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶(PARP)奥拉帕尼、尼拉帕尼、瑞卡帕尼和抗血管生成剂贝伐单抗。外泌体和外泌体模拟物在靶向药物的治疗剂递送中的新兴作用已得到广泛认可。外泌体是理想的天然纳米载体，具有优越的膜穿透性、生物相容性、无不良免疫原性等优点，它参与蛋白质和遗传物质在细胞之间的水平转移，使它们在药物蛋白及核酸传递占据独特优势。有报道发现，卵泡刺激素受体-β（FSHβ）链特定的氨基酸片段能够特异性的识别FSHβ阳性的卵巢癌细胞，锚定FSHβ的外泌体通过其表面的特异表达分子诱导外周血T淋巴细胞的增值效应从而激发其抗肿瘤效应；四个对照组中，负载Exo-some/FSHβ的树突状细胞能显著激活T细胞的卵巢癌细胞杀伤力。这项研究展示了外泌体装载靶向肽的潜力。天然的外泌体具有复杂的结构，它在疾病中的复杂机制仍存在很多疑点，用于药物制剂可能会造成不良影响，外泌体模拟物成为替代方法已被批准用于临床开发，如脂质体定制的模拟外泌体。除了基于外泌体的药物递送系统外，基于外泌体的免疫疗法也已经进入临床试验。有研究表明，肿瘤外泌体呈递给免疫细胞同时刺激神经胶质瘤患者免疫系统的肿瘤特异性抗原。靶向治疗是未来医学新希望，这对于发现时已较为晚期且预后较差的卵巢癌患者来说无疑是福音。

06/结语

近年来，外泌体在疾病中特别是癌症诊治中的相关研究迅速增长。现在的很多研究发掘出外泌体在癌症中的早期诊断能力，但是外泌体在癌症转归机制中的作用仍需进一步的研究。卵巢癌患者的早期诊断与外泌体有着千丝万缕的联系，已经显示出外泌体作为潜在生物标志物及靶标的极大潜力。对于不同的肿瘤细胞，特异性识别及纯化其外泌体将成为一项新技术。治疗性外泌体的生产仍然需要用不同类型的细胞进一步检验，利用外泌体作为递送载体的思路具有极大的研究价值。对于外泌体更深入的研究，未来仍将面临许多挑战。

肿瘤医学论坛整理自：《中国肿瘤》

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